小鼠超数排卵及附植前不同发育阶段胚胎采集与结构观察实验-显微镜观察法

小鼠体内精卵结合形成受精卵的过程是在输卵管壶腹部进行。小鼠第一次卵裂在受精后18～24小时；以后每隔12小时左右分裂一次。根据这一规律，基本上可以推算出早期卵裂胚胎各个时期的时龄，2-细胞为受精后约24～38小时，4-细胞为38～50小时，8-细胞为50～60小时，16-细胞为60～72小时。小鼠胚胎卵裂到8-细胞阶段时开始致密化，致密化的细胞分裂后，形成16-细胞的桑椹胚，在桑椹胚阶段，胚胎由输卵管进入子宫。在16～32细胞期(66～82小时)出现小的囊腔而进入囊胚期。囊胚期可分为四个阶段：16～32细胞期，囊胚腔很小，不易看见，为早期囊胚；有完整的囊胚腔，并能明显区分为内细胞团时为晚期囊胚；囊腔的体积进一步扩大，镜下像一个水泡，内细胞团相对较小的时期为扩张囊胚；扩张囊胚从透明带孵出后则为孵出囊胚，这时透明带并非溶解，而是由于子宫内及滋养层的一些酶使一部分透明带软化，囊胚细胞由软化部位钻出，孵化期的时龄约为96～110小时。通过实验安排的3次胚胎采集和观察时期，可学习到有关哺乳动物早期胚胎发育中的几个知识点。输卵管回收2～4细胞胚，主要观察透明带、极体、卵裂球，了解卵裂机理；输卵管或子宫角回收8细胞胚～桑椹胚，观察致密化过程，了解胚胎致密化现象；子宫回收囊胚，观察透明带、胚内细胞团、滋养层细胞、囊胚腔，了解胚胎细胞的分化现象。

材料与仪器

小鼠
生理盐水 孕马血清促性腺素 人绒毛膜促性腺素 胚胎回收操作液
电子天平 药勺 青霉素瓶 胶布 记号笔 注射器 针头 酒精棉球 镊子 显微镜 擦镜纸 恒温水浴锅 隔水式恒温培养箱 器械盘 酒精灯 手术剪 手术镊子 眼科剪 眼科镊子 眼科异物针 表面皿 平皿 胚胎吸管 检卵杯 酒精棉球 吸管 注射器 针头 针头盒

步骤

一、小鼠超排处理日程安排与超排处理
 

注：实验人数较多而所需小鼠数量较大时，为避免配种公鼠不足，可选择多批实验鼠交叉超排配种，实验内容相应交叉进行。
注射hCG后将处理的雌性小鼠1～2只放入一个笼子里，稍后放入1只公鼠同笼过夜。第3天上午7：00～8：00前，观察并记录配种母鼠的阴栓情况。超排用促性腺激素的剂量应合适，太少时排卵数较少，太大时排卵又太多而使受精后胚胎退化增多，反而减少可用胚的数量，并可能会降低可用胚的质量。由于激素生产厂家的不同或同一厂家生产的不同批号之间的激素活性有所差异，又由于小鼠对于超排激素的反应性因品系不同也有差异，故在正式实验前须对某一厂家或某一批号的激素进行预备试验，以确定其适宜剂量。

二、胚胎采集

1.  输卵管胚胎采集
输卵管采集与分离。由于小鼠输卵管非常细，不容易直接冲洗管腔采集胚胎。将装有输卵管及冲卵液的表面皿置于实体显微镜载物台上，在20或40倍镜下，用一支眼科用异物针固定输卵管，用另一支异物针纵向撕开输卵管，用此法将整个输卵管撕裂，胚胎会游离到液体中。

2.  子宫角胚胎回收  
按照实验三介绍的方法暴露两侧子宫角。用眼科镊子夹住子宫颈部(图4-5A)，并用眼科剪剪断子宫颈(图4-5B)。用镊子轻轻提起子宫，并用眼科剪剪开子宫系膜，直到子宫尖端，从输卵管与卵巢之间剪断(图4-5C)，采取子宫角。在含冲卵液的表玻皿中，用眼科剪除去子宫角上的系膜等附属物，并冲洗干净，用冲洗方法回收胚胎。

胚胎冲洗时，将子宫角放入平皿，用眼科剪分别纵向剪开宫管接合部，用装有冲卵液的注射器从子宫颈开口插入针头冲洗子宫腔，使胚胎随着液体流动而被冲出子宫(图4-6A)，每侧用液体1.0 mL左右。另一种方法是从子宫角基部剪断，将针头从宫管接合头插入而向子宫颈方向冲洗子宫腔而冲出胚胎(图4-6B)。

三、检胚及胚胎的形态学观察与鉴定

将含胚液体静置几分钟后进行检胚。检胚时，将含胚器皿置于实体显微镜下，先在低倍(15～20倍)下调整焦距，看到胚胎后，将回收液中的生殖道脱落细胞等异物用检卵针拨开，将胚胎用吸卵管移入含有新鲜冲卵液的检卵杯中，待全部胚胎检出后，进行净化处理。胚胎净化处理就是把检出的胚胎移入新鲜的冲卵液中清洗2～3次，以除去附着于胚胎上的污染物。洗涤时每次更换液体，用吸卵管吸取转移胚胎时，要尽量减少吸进前一容器内的液体，以防将污染物带入新鲜液体中。操作过程要轻巧迅速，避免损伤胚胎。

胚胎净化处理后，放入含有新鲜冲卵液的检卵杯中在60～80倍镜下观察，并进行形态学质量鉴定，区分正常与异常胚胎。

注意事项

1. 观察困难时，可提高放大倍数，仔细观察细胞结构。如果卵周隙大，内细胞团细胞松散，细胞大小不一或为很小的一团，细胞界线不清晰，则为退化胚或变性胚。

2. 有时还可以见到一些形态不规则的胚胎。未受精卵无卵周隙，透明带内为一个大细胞，细胞内有较多的颗粒或小泡。

3. 动物胚胎实验是在无菌环境下实验的，其中无菌的液体也是基本要求，配制的液体需要不时的观察颜色是否发生变化，是否浑浊是否有菌落产生。

常见问题

胚胎形态学质量鉴定可根据以下特征进行：

1.  胚胎的发育阶段和胚胎细胞的形态。

2.  胚胎的形态与匀称性,胚内细胞大小的变化。

3.  胞质的结构及颜色,胚内是否出现空泡、细胞碎片,有无脱出的细胞。

4.  胚胎的大小是否正常。

5.  透明带的形态和完整性。

正常胚胎的发育阶段与回收时应达到的胚龄一致，胚内细胞结构紧凑，胚胎呈球形。胚内细胞间的界线清晰可见，细胞大小均匀，排列规则。透光度一致，既不很亮又不太暗。细胞质中含有一些均匀分布的小泡，没有细颗粒或不规则分布的空泡。有较小的卵周隙，直径规则。透明带完整，无皱纹和萎陷。胚内没有细胞碎片。早期卵裂阶段的胚胎，可明显区分每个卵裂球之间的界限，可观察到单个卵裂球、极体、透明带等结构。致密化的８细胞及桑椹胚可见卵周隙，透明带内为一团细胞，改变反光镜角度，将入射光角度调节适当时，可见胚内细胞间的模糊界线。囊胚阶段的胚胎，主要观察胚内细胞团、滋养层细胞、囊胚腔、卵周隙、透明带等结构。观察时要用异物针拨动胚胎，从不同侧面观察，才能辨明细胞数和胚内结构。