小卫星可变重复序列 PCR

小卫星可变重复序列 PCR 的基本原理是，以 Jeffreys 最初建立的 MS32 位点的 MVR-PCR 分析为例。MS32 位点由 29 个核苷酸的重复单位串联形成，重复单位有两种类型：a 型和 t 型，a 型含有 HaeⅢ酶切位点，t 型由于该酶切位点中的 G→A 的碱基突变而不能被 HaeⅢ切割。针对这些重复单位的特点，设计 4 种引物：①TAG-A，是自 HaeⅢ切点起与 a 型重复单位互补的寡核苷酸链，在 5』端又接上 1 段由 20 个核苷酸构成的不能与模板互补的 TAG 顺序，其作用是防止 MVR 的两种特异性引物在 PCR 产物内部引导扩增而产生进行性 PCR 产物的缩短；②TAG-T，它与引物 TAG-A 只相差 1 个碱基，是一段与 t 型重复单位互补的顺序，也接上同样的 TAG 顺序；③引物 TAG，它与 TAG-A 中的 TAG 顺序相同，只能与扩增后链中的 TAG 顺序退火（图 13-1）； ④引物 32D 则选用小卫星 DNA 邻近的一段序列，其序列如下：5'-CGACTCGCAGATGGAGCAATGGCC-3'，或选用与重复序列更加邻近的一段顺序 32O，其序列为 5'-GAGTAGTTTGGTGGGAAGGGTGGTT-3』。

将样品分为 2 组：A 组和 T 组。加入 TAG 引物和 32D 引物后，分别加入 TAG-A 和 TAG-T 引物。TAG-A 和 TAG-T 作为下游引物单向扩增模板 DNA，获得带有 TAG 末端的扩增产物。32D 引物作为上游引物以带有 TAG 末端的扩增产物为模板进行 PCR 扩增产生带有 TAG 和 32D 末端的扩增产物。最后在 32D 和 TAG 引物作用下，扩增获得 A/T 型重复单位到 32D 区域的 PCR 产物群（图 13-2）。

当将 A、T 两组 PCR 产物经电泳分离后，将结果叠加，根据 Jeffreys 的编码原则，MVR 图谱中表现出 3 种重复单位：a 型在 A 行中出现带（在高加索人群中占 72.9%）； t 型在 T 行中出现带（占 25.5%）；。型在 A、T 行均无带。原因可能是重复单位内没有与 a 型或 t 型特异性引物相匹配的序列，这种概率很小，仅为 1.6%。样品基因组 DNA 的图谱是 A 行和 T 行谱带叠加的结果。根据叠加结果中带的强弱和有无分成 6 种等位基因，并分别用数字 1〜6 来表示。纯合子 中仅出现 1,2,6 三型。每个数字编码表示 1 个重复单元，含有相当丰富的信息量。

小卫星可变重复序列 PCR 的常用应用领域如下：

1. 人类遗传学研究

由于 MVR-PCR 在检测重复序列的长度多态性的同时也检测了重复序列的多态性，因此能够给人类遗传学研究提供更为丰富的遗传信息量。
以 Y 染色体的小卫星多态性位点 DYF155S1 为例。DYF155S1 为 Y 染色体上多态性最高的位点，由富含 AT 的 25 个碱基的重复序列串联形成。该重复序列存在 9 种类型。采用 MVR-PCR 对 DYF155S1 位点重复序列的多态性进行分析。发现在重复序列排列数序上，该位点 3』 端均为 4 型，并且从不出现 1 型；5』 端则往往为 1 型或者 3 型，并从不出现 4 型。由于 DYF155S2 位点均只含有 4 型的重复单位，因此被认为可能是 DYF155S1 的祖先位点，其中 4 型重复单位是祖先序列。此外，王保捷等对不同民族的 DYF155S1 位点结构分析显示该位点具有明显的民族差异。中国北方汉族以 3134 重复序列排列为主，日本群体则除占主体的 3134 排列外，还存在 6134 排列，其中 6 型重复单位只在日本群体中检出到。

由于 DYF155S1 位点的长度是 3' →5' 端不断延伸，而王保捷等人发现的 6 型和 7 型均局限在 5』端，该现象反映了人类进化的近期变化。如果跟踪观察该位点 5'端变化，则可为人类遗传进化的细节分析提供重要线索。

2. 法医学

MVR-PCR 方法在法医学中的应用，主要表现在个体识别和亲子鉴定两个方面。MVR-PCR 技术，不需要测量片段长度，不必使用 STR 分型时的等位基因阶梯 (allelic ladder), 相对比较简单，且分析结果客观、准确。

(1) 个体识别：据 Jeffrey 等的研究结果显示：小卫星 MS32 的杂合度为 99.1%，理论上只要借助 MS32 前 50 个重复单位的编码便可以区分 350（7×1023 ) 种不同的等位基因。国内资料显示：中国汉人 MS32 的前 50 个编码全部相同的概率为 4.09×1018；河北汉人群 MS32 前 50 个编码全部相同的概率为 3.55×108。对中国汉族人群另一小卫星 MS31A 进行 MVR-PCR 的 分析表明，前 40 个重复单位的 DP 值可达 99. 999999999999%。
单个小卫星 DNA 采用 MVR-PCR 方法获得的多态信息量高，适合法医学实践中微量检材或混合斑的鉴定。Hopkins 等对 1 张旧邮票上的唾液斑进行 D1S8 位点分析，得到了清晰的 MVR 编码。Monckton 等则从混合样品中含量少于 1% 的 DNA 样品中获得了免疫的 MVR- PCR 分析结果。郑秀芬等报道了用此方法单分析小卫星 MS32 为一起奸杀案的破获提供了直接的科学依据。Jobling 等采用 MVR-PCR 技术分析 Y 染色体特异小卫星 MSY1 基因座，基因多样性可达 99.9%, 远高于 10 个 Y 染色体 STR 基因座的基因多样性；2002 年庚蕾可釆用荧光 标记 MVR-PCR 方法和 ABI377 遗传分析仪，调査中国广州汉族 MSY1 基因座 5』端多态性，基因 多样性 3) 为 0.9789, 是目前仅作 1 次 PCR 能获得个体 Y 染色体多态信息较多的技术，而且 用于法医学混合斑检测的实际案例，获得满意的效果。这种 Y 染色体 MVR-PCR 方法在解决混 合斑男性成分的个人识别有一定的应用前景。侯光伟等应用 MVR-PCR (采用 4 级数字编码) 对 45 起刑事案件的物证进行鉴定，涉及的物证包括血痕、混合斑、毛发和骨组织等。无论是血痕 (最小为 4 mmX4 mm，载体则由纱布、石头、金属等) 还是混合斑 (时间 1〜4 年不等，载体有纱布、棉球等)，均通过 MVR-PCR 得到明确结论。

(2) 亲子鉴定：多位点 STR 分型已普遍用于目前的法医实践中。尽管 STR 很适合个体识 别，但应注意到，因为生殖系 DNA 中 STR 的突变率最高可达 0.7%, 所以在应用 10 个 STR 位 点的亲权鉴定案中，突变是无法忽略的。按照 STR 的平均突变率为 0.12% 计算「每三个亲权案中」假性排除的可能性将达到 2%。当出现单位点排除的案例时，为证实被鉴定人之间是否存在 亲权关系，便增加了 STR 的检测数目。但同时这些位点的突变概率也随之提高了。目前研究表 明，对于出现单个 STR 位点不匹配的案例，等位基因特异性 MVR-PCR 将是判定该位点的差异 是否属于假性排除的最有力工具之一。如果孩子的某等位基因的 MVR 图谱与其假定父亲或母 亲的同一位点等位基因的 MVR 图谱一致，那么亲权指数将会明显提高。

Tamaki 等报道运用 MVR-PCR 技术分析 MS31A 和 MS32 两个小卫星基因座在一缺乏母 亲的父权鉴定中的优势；2001 年，Yamamoto 等在用 10 个 STR 基因座检测一男孩、女孩与已 故父亲之间的关系，由于 STR 基因座的突变，可能排除了男孩与父亲的亲子关系，而联合分析 MS31A 和 MS32 两个小卫星基因座等位基因特异性 MVR-PCR 图，确定了男孩与父亲的亲子关系。