采用 qRT-PCR 检测细胞炎性因子

一、原理

qPCR 技术通过引物特异性扩增目标 DNA 序列，并通过荧光探针或 SYBR Green I 荧光染料法检测 PCR 产物的数量，来定量分析样品中目标序列的数量。qPCR 技术具有快速、准确、高灵敏度和高特异性等优点。

二、用途

广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等领域。

三、材料与仪器

1、试剂：
RNA 提取试剂盒、反转录试剂、qRT-PCR 试剂盒、细胞炎性因子引物（探针法还需要一个探针）、PBS、DEPC 水等；
2、材料：
无 RNA 酶、EP 管及八连排 PCR 管、无 RNA 酶的枪头等。

四、步骤

1、细胞培养：将待检测的细胞接种在培养皿中，依据实验目的处理细胞，待收集细胞时，用 PBS 轻柔清洗 2~3 次以去除培养基对后续试验的干扰。
2、RNA 提取：使用 RNA 提取试剂盒，从细胞中提取总 RNA，并使用紫外分光光度计检测 RNA 浓度和纯度，A260/A280 在 1.8~2.1，表明 RNA 样品可用。RNA 很不稳定，易降解，建议测定完成后尽快进行反转录反应。
3、cDNA 合成：根据反转录试剂说明书分为两步，一是去除基因组 DNA，二是反转录反应获取 cDNA。此步骤完成后可将 cDNA 冻存于-80℃ 以备用。
4、qRT-PCR 反应：设计并合成引物，随后以 cDNA 为模板，使用细胞炎性因子的特异性引物进行 qRT-PCR 扩增反应。反应完成后，确认扩增曲线和融解曲线，对标准曲线进行分析。
5、数据分析：使用 qRT-PCR 仪检测荧光信号，导出 Ct 值，以β-actin 作为内参基因，采用 2-△△CT 法来计算细胞炎性因子的表达水平。

五、注意事项

1、RNA 提取：RNA 提取的质量和纯度对于后续的 cDNA 合成和 qRT-PCR 检测都非常关键。需要使用高质量的 RNA 提取试剂盒，并严格按照说明书操作。在提取 RNA 的过程中需要注意避免 RNA 的降解和污染。
2、cDNA 合成：cDNA 合成是将 RNA 转录成 cDNA 的过程，需要选择适当的逆转录酶、引物和反应条件。在反转录前需要对 RNA 进行 DNA 酶消化，避免 DNA 污染影响后续的 qRT-PCR 检测。
3、引物和荧光探针设计：对于细胞炎性因子的检测，需要设计特异性的引物和荧光探针，以确保只扩增目标序列并减少假阳性的发生。可以使用在线工具（Primer3 等）设计合适的引物和荧光探针，也可以向商家购买。
4、若 SYBR Green 染料法，在 qPCR 反应体系中，需根据 PCR 仪器型号选择是否加入 ROX 染料。
5、数据分析：qRT-PCR 检测的结果需要通过数据分析软件进行处理。需要注意数据的标准化和统计学分析。同时，需要对实验结果进行验证和重复实验，以确保结果的可靠性。