RT-PCR技术

提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA，再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。

仪器：电泳仪、凝胶图像分析系统、移液枪、离心机、水浴锅；

试剂：RNA 提取试剂、 dNTP 混合物、Taq DNA 聚合酶、第一链 cDNA 合成试剂盒、DEPC H2O、Oligo（dT）；

耗材：组织、细胞、离心管、PCR 管、移液管、离心管盒。

一、总 RNA 的提取

见 总 RNA 的提取 相关内容。

二、cDNA 第一链的合成

目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

1．在 0.5 ml 微量离心管中，加入总 RNA 1-5 ug，补充适量的 DEPC H2O 使总体积达 11 ul。在管中加 10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心；

2．70 ℃ 加热 10 min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min；

3．取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列试剂：

第一链 cDNA 2 ul；

上游引物（10 pM）2 ul；

下游引物（10 pM）2 ul；

dNTP（2 mM）4 ul；

10x PCR buffer 5 ul；

Taq 酶（2 u/ul）1 ul。

轻轻混匀，离心。42 ℃ 孵育 2~5 min；

4．加入 SuperscriptⅡ 1 ul ，在 42 ℃ 水浴中孵育 50 min；

5．于 70 ℃ 加热 15 min 以终止反应；

6．将管插入冰中，加入 RNase H 1 μl，37 ℃ 孵育 20 min，降解残留的RNA。-20 ℃ 保存备用。

三、PCR

1．取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列试剂：

第一链 cDNA 2 ul；

上游引物（10 pM）2 ul；

下游引物（10 pM）2 ul；

dNTP（2 mM）4 ul；

10x PCR buffer 5 ul；

Taq 酶（2 u/ul）1 ul；

2．加入适量的 ddH2O，使总体积达 50 ul。轻轻混匀，离心；

3．设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28~32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参（如 G3PD）的特异性引物，同时扩增内参 DNA，作为对照；

4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；

5．密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

1．在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂；

2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；

3．内参的设定：主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；

4．PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定；

5．防止 DNA 的污染：采用 DNA 酶处理 RNA；在可能的情况下，将 PCR 引物置于基因的不同外显子，以消除基因和 mRNA 的共线性。

1．反转录酶的选择

（1）Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶 H 活性相对较弱。最适作用温度为 37 ℃；

（2）禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。最适作用温度为 42 ℃；

（3）Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在 Mn2+ 存在下，允许高温反转录 RNA，以消除 RNA 模板的二级结构；

（4）MMLV 反转录酶的 RNase H-突变体：商品名为 Superscript 和 SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的 RNA 转换成 cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 mRNA 模板合成较长 cDNA。

2．合成 cDNA 引物的选择

（1）随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96% 来源于 rRNA。

（2）Oligo（dT）：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3' 端 Poly（A+）尾，此引物与其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly（A+）RNA 仅占总 RNA 的 1~4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方面均要小。

（3）特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与 mRNA 3' 端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。