半巢式 PCR

半巢式 PCR 是利用三条引物进行两次 PCR 扩增的方法，与巢式 PCR 原理相同，只是在第 2 轮 PCR 反应中使用的引物有 1 条为第 1 轮 PCR 的引物。

半巢式 PCR 的基本原理是当用于当模板 DNA 含量较低时，一次 PCR 难以得到满意的结果，需要进行两轮 PCR 扩增，与巢式 PCR 相比，在基因的 5' 末端或者 3' 末端无法设计出两条引物外引物和内引物，只能设计出一条引物的情况下，宜采用半巢式 PCR。

仪器：PCR 扩增仪、电泳仪、移液器；

试剂：

① 模板：基因组 DNA 或 cDNA；

② 2.5 mmol/L dNTP 混合液；

③ 10 μmol/L 三条特异引物：两条外引物，一条内引物；

④ Taq DNA 聚合酶及其 10× PCR 缓冲液；

⑤ 高压灭菌去离子水；

耗材：PCR 管、移液枪头。

半巢式 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

在某些情况下，由于所要研究的基因位于整个基因组的 5' 末端或者 3' 末端，这样在基因的 5' 末端或者 3' 末端就无法设计出两条引物——外引物和内引物，只能设计出一条引物，而在基因的另一端仍然可以设计两条引物，在两次 PCR 中有一端的引物要利用两次，半巢式 PCR 的引物设计原则与常规 PCR 相同，共设计三条引物。内引物与外引物间隔多长距离没有统一的要求，具体情况根据每个实验而定。

（二）半巢式 PCR 反应：

A. PCR 反应体系：进行第一轮 PCR 反应，50 μl 的 PCR 反应体系，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：10× PCR 缓冲液 5 μl，DNA 模板 3 μl，2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl，Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.5 μl，10 μmol/L 的外引物（P1，P2）各 1 μl，最后加 H2O 至 50 μl。

B. 如果 PCR 仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油（约 50 μl）。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

C. 设置 PCR 反应条件：预变性 94 ℃，3 min，变性 94 ℃，30 s，退火 55 ℃，30 s，延伸 72 ℃，60 s，30 个循环，延伸 72 ℃，7 min。

D. 进行第二轮 PCR 反应，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：10× PCR 缓冲液 5 μl，第一轮 PCR 扩增产物 3 μl，2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl，Taq  DNA 聚合酶（5 U/μl）0.5 μl，10 μmol/L 的外引物（P1 或 P2）和内引物 P3 各 1 μl，H2O 至 50 μl。PCR 反应条件同第一轮，反应中的条件与循环数视具体情况而定。

E. 有些情况下，也可进行一管式半巢式 PCR，例如 50 μl 的反应体系，分别加入：10× PCR 缓冲液 5 μl，模板 3 μl，2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl，Taq  DNA 聚合酶（5 U/μl）5 μl，10 μmol/L 的外引物（P1、P2、P3）各 1 μl，H2O 至 50 μl。PCR 反应条件同第一轮，反应中的条件与循环数视具体情况而定。反应结束后，用 10 μl 第二轮 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1、PCR 反应中的退火温度要根据引物的 Tm 值而定，延伸时间根据酶的合成速度和扩增条带的长度设定，一般来说每分钟合成 1 000 bp 左右。

2、半巢式 PCR 较巢式 PCR 反应特异性有所降低，易造成非特异产物，为了克服这个缺点，可以采取提高退火温度，从常用的 55 ℃ 提高为 60 ℃。从而使模板与引物之间的识别特异性提高，以提高反应的特异性。

3、半巢式 PCR 多采用第一轮产物直接稀释作为第二轮循环模板，此稀释混合物中的引物和模板对于第二轮扩增有一定干扰作用，易造成背景高、非特异产物多的缺点，通过对第一轮产物的初步分离获得纯化的核酸产物，再作为第二轮循环模板可得到更为理想的结果。