植物原生质体的制备

去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作，也可以利用酶解法。较早利用机械法制备原生质体的首推Klercker（1892），直到1960 年英国科学家Cocking 才第一次用酶法大量制备原生质体。本实验以植物的叶肉组织为材料，利用纤维素酶和果胶酶来消化细胞壁，分离细胞。

材料与仪器

油菜或菠菜或烟草
氯化钙 蒸馏水 2蔗糖 酶解液
显微镜 离心机 离心管 剪刀 镊子 吸管 培养皿 载玻片 盖玻片

步骤

1、取材 根据实验目的和条件选取不同的材料

2、分离原生质体

（1） 撕叶下表皮

（2）酶解 将撕去下表皮的叶片剪成小块，放在盛有5mL 酶液的小培养皿中，让去除下表皮的一面接触酶液，辅满一层，在25——28℃下酶解60——90 分钟

3、收集纯化

（1）用吸管将酶解液吸至5mL 离心管中，以600rpm 离心5 分钟以上，使原生质体沉降

（2）将上清（酶解液）回收，剩下原生质体及残渣于管底

（3）加氯化钙液约2mL，轻轻吹打均匀

（4）用注射器向离心管底部缓缓注入蔗糖约2—3mL，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液

（5）以600rpm 离心10 分钟，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的原生质体

4、观察或培养

取少许原生质体于载片上，盖片观察其形态，或者将原生质体接种在培养基上进行培养，再生植株。

注意事项

要培养悬浮细胞系需较长时间。因此,应着重改善培养条件,主要包括选用合适 的培养基 包括培养基 种类 、添加物 、激素种类及水平等 及培养方式 根 据培养物状态适时改换适宜培养基 选择合适的外植体及诱导时期 。

常见问题

原生质体是裸露的、具有生命活性的细胞,体内包裹着细胞核、细胞器、细胞质等, 因此原生质体具有再生细胞壁、进行连续分裂并生成完整植株的能力 , 即具有细胞全能性。原生质 体能 摄 人 如 DNA、质粒 、病毒 、细菌 、细胞器等外源物质 , 是植物细胞工程进行遗传操作 、基因转移的良好材料 。