大鼠精子冻存保存方法

冻存（cryopreservation）是生物材料保存的主要方法之一。利用冻存技术将胚胎、配子或卵巢置于-196 ℃液氮中低温保存，可以使胚胎、配子或卵巢暂时脱离生长状态而将其生理特性保存起来，这样在需要的时候再复苏用于实验。

适度地保存一定量的胚胎、配子或卵巢，可以防止因意外事件而造成丢种，起到了胚胎、配子或卵巢的保种作用。

除此之外，还可以利用冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些特殊基因型的胚胎、配子或卵巢。

材料与仪器

器材：

①冻存管

②无菌移液枪、枪头

③超低温冰箱

④CO2、37 ℃恒温箱

⑤程序降温仪（KRY010，Planer，英国）

试剂：

①材料：雄鼠

②Tes、Tris、PBS

③葡萄糖、卵黄、十二烷基硫酸钠（SDS）

④液氮

⑤甘油

步骤

大鼠精子冻存的基本过程可分为如下几步：

1．取精子 。

2．配制精子冻存保护液（表4-6-1），37 ℃预热。

成分 浓度 成分 浓度

Tes 21.07 mmol/L 卵黄 25%

Tris 9.49 mmol/L 十二烷基硫酸钠（SDS） 0.1%

葡萄糖 2.22 mmol/L 甘油 5%

3．取3月龄以上有繁育能力的雄鼠，颈椎脱臼处死。

4．腹部75％ 乙醇消毒，打开腹腔，取附睾尾。

5．在磷酸盐缓冲液（PBS）中简单漂洗2次，去除血细胞后置于1 ml冻存保护液中。

6．用眼科剪剪3刀，5％ CO2、37 ℃恒温箱中孵育10分钟，使精子游出；将精子装入麦管，准备冻存。

7.利用程序降温仪（KRY010，Planer，英国）进行程序冻存，起始温度为20 ℃；以3 ℃／min的速率降至4 ℃，平衡3分钟；5 ℃／min降至-4 ℃；10 ℃／min降至-30 ℃；20 ℃／min降至-80 ℃，平衡10分钟；投入液氮。