不依赖连接反应的克隆 PCR 实验

当今，PCR 技术已成为分子生物学领域一种有力的研究工具，应用于现代分子生物学各个方面。人们发明各种各样 PCR 方法来克隆基因，因而在基因克隆和载体构建上，PCR 技术得到广泛的应用，并业已成为传统重组基因技术的一种必要的补充手段。常规的克隆和重组 DNA 技术需要用限制酶对 DNA 片段进行消化和用连接酶将两个片段连接起来。但有时待克隆的基因没有合适的限制酶切位点，不能用常规的重组 DNA 技术将其克隆。为克服该困难，人们就设法应用不需要连接反应的 PCR 克隆方法，于是不依赖连接反应的克隆 PCR (ligation-independent clo¬ning PCR, LIC-PCR) 就应运而生。人们发明了两种不同的不需要连接反应的 PCR 克隆方法，这些方法都在扩增的 DNA 片段的 两端产生大约 10〜12 个碱基的单链末端，它们能够同载体的互补序列发生特异性的退火，然后 就可以转化感受态细菌，而不必进行连接反应。一种由 Aslanidis 和 deJongW 发明，他们在设计 PCR 引物时，使引物未端 12 个或更多的碱 基中只有三种核昔酸•然后对获得的 PCR 产物用 T4 DNA 聚合酶进行消化，并且在消化液中掺 入了在产物 3』端没有出现过的核昔酸。另一种能使 PCR 产物两端产生突出末端的方法就是利用尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG)。

不依赖连接反应的克隆 PCR 实验的基本原理是利用尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG)。UDG 酶是参与 TTP 生物合成的一种酶，它能水解脱氧核糖基团与尿嘧啶之间的 N-糖昔键。这种酶解反应产生脱碱基的 dU 残基，从而破坏 DNA 的碱基配对。此法就是在引物的 5』端加上掺入脱氧尿嘧啶的尾巴，并用 UDG 选择性地去掉 PCR 产物 5』端的突出脱氧尿嘧啶。这些产物就可以同含有互补序列的合适载体退火，从而使载体和插入的外源片段形成环状。这种重组质粒就可以有效地转化入大肠杆菌中 (图 10-15) 。这种方法重要的就是要使产物的 3』突出端含有足够数目的核昔酸残基，从而能够使载体插入的 PCR 产生的 DNA 片段发生稳定有效的退火反应。另外，在引物设计时，将 dUMP 安插在 PCR 模板与载体互补序列的连接处，以及在寡核昔酸引物的 5'端添加入几个 dUMP 残基也很重要，经 UDG 酶切后，使寡核昔酸中其它碱基失去与互补链的相互作用，从而产生岀单链的突出端。

器材：

PCR 仪、电泳仪。

试剂：

①待扩增基因的上游引物 P1（5』端为 CUACUACUACUA）和下游引物 P2（5『端为 CAU- CAUCAUCAU）。

②模板（mRNA 或 cDNA）

③热稳定聚合酶及 10X 缓冲液

④10 mmol/L dNTP

⑤pAMPl 载体（25 ng/μL）

⑥退火缓冲液

⑦尿嘧啶 DNA 糖基化酶（1U/μL）

不依赖连接反应的克隆 PCR 实验的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

A 用于 LIC-PCR 的上游引物 R 的 5』端为 CUACUACUACUA, 再加上待扩增基因的互补序列；下游引物 P2 的 5』端为 CAUCAUCAUCAU, 再加上待扩增基因互补序列。

（二）PCR 反应

A 按照标准 PCR 反应体系，加入所需试剂，进行标准的 PCR 反应。

（三）退火反应

A 在 0.5 mL 离心管中加入以下试剂（置于冰上）

B 混合均匀，37 °C 温育 30 min 后置于冰上。

（四）转化

A 取退火反应液 1〜5 叫转化 DH5a 感受态细菌。

1 CLONEAMP 试剂盒提供一 44 bp 的阳性对照 DNA, 退火反应时加入叩 1（约 25ng）到反 应体系中。

2 重组子的多样性直接同 PCR 产物的多样性相关，也就是说若 PCR 产物中包括很多种扩增 片段，那就有可能每一种 PCR 产物的末端含有脱氧尿嚅嚏的引物特异连接片段。这也是一种建 立 PCR 文库的理想方法，人们也就可以根据自己所需筛选理想克隆。

3 一些扩增反应可能会产生引物二聚体等非目的产物，这就需要重新设计引物，可以用 dTMP 来代替 dUMP, 这样就不会产生由 dU 引起的引物二聚体问题。