通过重叠延伸和基因 SOEing 进行 PCR 突变实验

无菌 H2O PCR 缓冲液 限制性酶和缓冲液 Taq DNA 聚合酶 PCR 模板 5'和 3'引物 dNTP
DNA 测序装置 热循环仪 琼脂糖凝胶电泳设备

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

无菌 H2O

2. 酶和酶缓冲液

10XPCR 缓冲液（Roche)，包含 100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/L，KCl 和 15 mml/LMgCl2

限制性酶和缓冲液

Taq DNA 聚合酶（Roche)

3. 核酸和寡核苷酸

10X dNTP, 商品出售的 dNTP 溶液（AmershamBiosciences) 是 100umol/L 浓度的储存液，可以用无菌水稀释。

PCR 模板

5'和 3'引物

4. 特殊设备

DNA 测序装置

热循环仪

5. 其他

琼脂糖，分离 DNA 片段所需的琼脂糖浓度依赖于需要分离的片段的大小。依经验，0.8%~1% 的 SeaKem GTG 琼脂糖（Cambrex)(用 1XTAE 配制）一般都能够令人满意地分离 0.25~2kb 大小的 DNA 片段。

琼脂糖凝胶电泳设备

GENECLEANⅡ试剂盒（BIO101)

6. 载体和菌株

PCR 产物测序所需的克隆载体和菌株。

二、方法

1. 通过重叠延伸进行 PCR 突变

（1）在独立的微量离心管中进行 PCR 反应生成产物 AB 和 CD(参见图 32-1)。这些反应混合物能够在室温下混合。


（2）反应进行 30 个循环（94℃ 1min, 50℃ 1min, 72℃ 2 min)。

（3）将每个反应的所有反应物进行琼脂糖凝胶电泳。

（4）切下目标条带（即产物 AB 和 CD)，用 GENECLEANUⅡ试剂盒回收 DNA 片段。

（5）在一个新的微量离心管中进行重叠延伸反应。


这一反应对于加入的模扳量不十分敏感。通常每种模板可以使用 10~100ng。引物 a 和 d 也可以在PCR 反应的开始就加入。

（6）参照上面的步骤 2 进行 PCR 扩增。

（7）将反应物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目标条带（即产物 AD)，参照步骤 4 回收 DNA片段。

（8）纯化的突变产物 AD 随后可以被适当的限制性酶所消化，然后连接到一个合适的克隆载体上进行后续的转化和测序。

2. 基因 SOEing

（1）在独立的微量离心管中进行 PCR 反应，以分别产生来自基因 1 的产物 WX 和来自基因 2 的产物 YZ(图 32-2)。



（2）反应进行 30 个循环（94℃ 1min, 50℃ 1min，72℃ 2min)。

（3）将每个反应的所有反应物进行琼脂糖凝胶电泳。

（4）切下目标条带（即产物 WX 和 YZ), 用 GENECLEANB 试剂盒回收 DNA 片段。

（5）在一个微量离心管中进行 SOEing 反应。



（6）参照上面的步驟 2 进行 PCR 扩增。

（7）将反应物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目标条带（即产物 WZ), 参照步骤 4 回收 DNA 片段。

（8）纯化的突变产物 WZ 随后可以被适当的限制性酶所消化，然后连接到一个合适的克隆载体上进行后续的转化和测序。