详细描述巨噬细胞原代培养中细胞分离与培养的具体步骤

一、实验准备

‌1. 实验动物与试剂‌

①选择合适的实验动物，如SPF级小鼠，体质量通常在18～22g，雄性，6～8周龄。

②准备必要的试剂，包括细胞培养基（如RPMI 1640）、胎牛血清（FBS）、双抗（抗生素和抗真菌剂）、红细胞裂解液、PBS（磷酸盐缓冲液）、以及用于诱导巨噬细胞分化的细胞因子，如M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）。

‌2. 实验器械‌

一次性注射器、手术器械（如眼科剪、眼科镊）、离心管、细胞培养皿、移液枪及枪头等，并确保所有金属器械经过高压灭菌，离心管辐照消毒。

二、细胞分离

腹腔巨噬细胞分离

‌1. 腹腔注射刺激物‌

在实验前三天，每天给小鼠腹腔注射1mL的3%巯基乙酸盐肉汤，以刺激巨噬细胞增殖。

‌2. 处死小鼠并收集腹腔液‌

⑴采用脱颈法处死小鼠，将小鼠浸泡在75%乙醇中灭菌3-5分钟，然后移至超净工作台。

⑵用预冷的PBS或细胞培养基冲洗腹腔，轻轻按摩小鼠腹部数次，使液体在腹腔内充分流动。

⑶抽取腹腔液，收集至离心管中，并重复冲洗腹腔以增加细胞收集量。

‌3. 细胞分离与纯化‌

⑴将收集的腹腔灌洗液在常温条件下以1000rpm/min离心10分钟，弃去上清。

⑵用细胞培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。

⑶将细胞悬液接种至细胞培养皿中，置于37℃培养箱中孵育2～3小时，使巨噬细胞贴壁。

⑷弃去未贴壁的细胞，余下的贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞。

骨髓巨噬细胞分离

‌1. 提取骨髓细胞‌

①处死小鼠后，用剪刀和镊子取出其双侧股骨和胫骨，剔除附着的肌肉和组织。

②将骨骼浸泡在75%乙醇中灭菌后，用冷的PBS清洗。

③使用注射器吸取含有M-CSF的诱导培养基，反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液。

‌2. 细胞培养与诱导分化‌

①将骨髓细胞悬液过筛后离心，去除红细胞和杂质。

②用含有M-CSF的诱导培养基重悬细胞，并接种至细胞培养皿中。

③在37℃培养箱中培养，每隔2-3天更换新鲜培养基。

④培养7天后，收集贴壁的骨髓巨噬细胞用于后续实验。

三、细胞培养

‌1. 细胞贴壁与换液‌

巨噬细胞贴壁后，需定期更换新鲜的培养基以维持细胞生长环境。

每隔2-3天更换一次培养基，并在更换前用PBS清洗细胞以去除死细胞和杂质。

‌2. 细胞形态观察‌

使用倒置显微镜定期观察细胞形态和生长状态。

巨噬细胞通常呈规则圆形或不规则形状，贴壁较快且具有较强的吞噬能力。

‌3. 细胞计数与活性检测‌

⑴使用细胞计数板对细胞进行计数，并计算细胞活性。

⑵细胞活性检测通常使用台盼蓝染色法，通过计算活细胞与总细胞的比例来评估细胞活性。

通过以上步骤，可以成功分离并培养出高质量的巨噬细胞原代细胞，为后续的实验研究提供可靠的细胞来源。