用 PCR 对一个随机多肽 DNA 文库的质量进行控制实验

ddH20 Vent 缓冲液 Vent DNA 聚合酶 dNTP 引物 质粒 DNA
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备 热循环仪

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

ddH20

2. 酶和酶缓冲液

10X Vent 缓冲液

Vent DNA 聚合酶

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP，各 20 mmol/L

引物，可以与合成的 DNA 文库克隆位点两侧的载体序列退火

质粒 DNA(见下面第 1 步）

4. 特殊设备

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭 (见第 5 步）

热循环仪

二、方法

1. 在细菌中扩增后，用随机多肽文库制备的质粒进行下面的反应。

10~50ng 的质粒 DNA

50pmol 的各引物

5ul 的 10X Vent 缓冲液

dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul

1U 的 Vent DNA 聚合酶

用 ddH20 定容至 50ul

下面的各种质粒载体，应该分别进行反应：

表达载体，没有文库 DNA 插入

DNA 文库的混合物

少量 DNA，由 DNA 文库的单个细菌克隆制备

2. 在一个热循环仪中，94°C 将混合物预热 20s。

3. 按下面的参数进行 30 轮 PCR 循环。

94°C10s

55°C10s(或用引物的合适退火温度）

72°C15s

将最后一个循环的延伸时间延长至 30s。

4. 冷却至 4°C。

5. 取 25ul 的各反应产物，跑 4% 的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色分析（Sam-brook and Russell 2001)

三、分析

在图 26-4 所示的例子中，用 12 个核苷酸的随机文库混合物作为模板，分析 PCR 产物显示，



文库的大部分都含有正确大小的插入（图 26-4，第 2 泳道）。而且，检测不到与原始载体对应的 PCR 产物（比较图 26-4 第 1 泳道和第 2 泳道）。用 PCR 分析随机选择的文库中的单个克隆，证实绝大部分插入片段大小是正确的，而且文库中没有原始载体的污染（图 26-4，第 3~20 泳道）。分析 DNA 的序列证实，这些 PCR 产物正是 12 个核苷酸随机文库的正确成员（数据没有列出）。因此，对反应中间产物（方案 2 图 26-3) 进行 PCR 分析后估计，已经获得了高质量的最终文库（图 26-4)。