TUNEL染色实验原理和实验操作技巧

一、实验目的

采用TUNEL染色技术检测细胞样本中的凋亡水平。

二、实验原理

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180~200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上生物素标记的dUTP，在DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），从而可以通过显微镜检测细胞凋亡的情况

三、实验材料

1.主要仪器耗材

2.主要试剂

四、方法步骤

1.固定

(1) 在培养板中将已爬好细胞的玻片用生理盐水浸洗3次；

(2) 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， 生理盐水浸洗玻片3次；

2. 通透

1) 蛋白酶K修复：每个样本上滴加100 μL蛋白酶K工作液，37℃反应30 min；

2) PBS浸洗3次各5 min。

3 .标记

1) 每样滴加50μL的Tunel反应混合物，TdT酶：Biotin-dUTP=1：9配制，37℃避光孵育60 min；

2) PBS洗涤1次，滴加反应终止液室温孵育10min；PBS洗涤5min×3次；

3) 每个样本滴加50 μL Streptavidin-HRP工作液，湿盒中37℃避光反应30 min；

4) PBS充分浸洗3次各5 min。

4. 显色

1) 根据说明书配制DAB显色液；

2) 每个样本滴加50 μL DAB显色工作液，室温显色30s-5min；

3) 蒸馏水稍洗终止显色。

5. 复染

1) 苏木素染色30 s；

2) 流水冲洗2 min。

6.分化返蓝

1) 1%盐酸酒精分化2 s；

2) 流水冲洗切片5 min。

7.干燥封片

1)  爬片自然干燥；

2) 在载玻片的中央滴加适量中性树胶，将爬片反扣在树胶上封固；

2) 在通风橱内室温晾干。

8.镜检

显微镜下观察拍照。