长白猪精原细胞的分离和纯化

一、材料和方法

1、实验动物

长白种系公猪，2月龄，由北京养猪中心苇沟现代化猪场提供。取活体睾丸，立即放入1640营养液中，待分离细胞。

2、主要试剂及材料

胶原酶（CLS，Sigma），胰蛋白酶（Sigma），脱氧核糖核酸酶（DNase,Promega），牛血清白蛋白（BSA，中国医学科学院天津血液研究所），胎牛血清（FBS，Gibco），RPMI 1640培养基（Gibco，临用前配制，加链霉素及青霉素至终浓度分别为100mg L及80IU ml，调pH至7 3），其他化学试剂均为国产分析纯。800ml容量的细胞沉降池（定做）。

实验用金属及玻璃器皿用前均清洗干净并高压灭菌处理。

3、石蜡切片的制备及染色

新鲜睾丸除去包膜及白膜，切取0 5~1 0cm3左右的小块，立即置入Bouin固定液中，4℃固定24h。按常规步骤制作石蜡切片，HE染色。

4、单细胞悬液的制备

无菌操作置睾丸于PBS溶液中，小心切开包膜，除去脂肪、附睾及白膜，切取1g左右睾丸组织，用弯剪剪成1mm3大小的碎块，移入离心管，加5ml含0.5g L胶原酶的PBS，33℃温育15min，其间不断震摇并用吸管吹吸数次。静置4~5min，待组织和细胞沉降管底后，弃上清。

重复上述步骤1次。加入5ml含0.5g L胰蛋白酶和1.0mg LDNase的PBS，33℃，温育15min，吸管轻轻吹打3min直至滴片镜检时视野中全是散在的单细胞及少量小的细胞团。1000r min离心10min，弃上清，并用PBS清洗两次，细胞沉淀最后重悬在含0. 5%BSA的PBS中，100目筛网过滤，制成单细胞悬液并进行细胞计数。

5、细胞的沉降分离

固定沉降池并保持水平状态，池底下口周围加数十粒硅化玻璃珠。10mlPBS及10ml待分离的单细胞悬液按先后从底部下口载入沉降池。用1640培养液分别配制4%和2%的BSA溶液各250ml，同时分别倒入梯度发生器的两个容器中。

梯度发生器出液口直接用橡胶软管连接于沉降池的底部尖嘴下口。打开活塞，调整流速，使BSA溶液以15ml min的速度从底部进入沉降池。最终沉降池内的液体从上而下形成2%~4%的BSA连续梯度。

整个沉降系统4℃静置3h，以使细胞按不同大小在BSA连续梯度介质中通过自然重力沉降而分层。分层后的细胞溶液从沉降池底部下口用自动收集器收集，控制流速为5ml/min，10ml 管作为1份。1000r min离心10min，沉淀细胞，弃上清。

细胞重悬于0.5ml含0 5%BSA的1640培养液中。将各管细胞分别滴片，HE染色，光学显微镜下检测细胞的形态结构特征及均一程度，以确定细胞的类型及纯度。合并同类细胞，取1滴细胞悬液，加10μl0.4%台盼蓝，计细胞总数及死亡细胞百分比。

最后调整细胞浓度为106个/ml。滴片，染色。显微镜下任选5个视野，计算细胞纯度。

6、细胞的贴壁培养及纯化

经沉降分离的精原细胞中混有少量支持细胞及间质细胞，将此细胞悬液接种到一次性无菌培养瓶中，于37℃、5%CO2及饱和湿度等条件下培养6~8h，支持细胞和间质细胞贴壁而精原细胞尚未贴壁，轻轻摇动培养瓶使精原细胞充分悬浮，吸出培养液，显微镜下再次检测细胞纯度及数量，并计算均值。