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PCR

限制性片段长度多态性（RFLP）分析

2024-05-17 PCR 加入收藏

原理1. DNA 限制性内切酶具有识别特定的DNA 序列并在特定的部位切断DNA 双链的活性功能，DNA 分子由于突变（核苷酸的置换、插入或缺失）改变（或形成）

原理

1. DNA 限制性内切酶具有识别特定的DNA 序列并在特定的部位切断DNA 双链的活性功能，DNA 分子由于突变（核苷酸的置换、插入或缺失）改变（或形成）了限制性内切酶识别序列，使DNA 限制性内切酶不能（或可以）将靶DNA 片段切断，电泳检测时，存在相应DNA 限制性内切酶识别序列者原DNA 片段变成短片段；不存在相应DNA 限制性内切酶识别序列者原DNA 片段长度将不发生变化。

2. 通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同的带，然后再与克隆DNA探针进行southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱，它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。

材料与仪器

模板DNA
限制性内切酶BstNI Taq聚合酶 PCR引物丙烯酰胺酶消化缓冲液电极缓冲液上样缓冲液
PCR 扩增仪电泳仪电泳槽微波炉恒温箱恒温水浴

步骤

1.PCR扩增：PCR反应体系为20μl，含模板2μl（约50ng），引物各1.6μl，dNTP1.6μl（0.4mM），10×Buffer缓冲液2μl，Taq酶0.5U，加双蒸水至20.0μl；PCR反应条件为95℃2min，94℃30sec/64℃30sec/72℃30sec（5个循环），94℃30sec/63℃30sec/72℃30sec（5个循环），94℃30sec/60℃30sec/72℃25sec（23个循环），94℃30sec/60℃30sec/72℃1min。

2.PCR 扩增产物的检测：取PCR 扩增产物2μl，以1%的琼脂糖凝胶潜水电泳法检测靶DNA 片段的扩增产物。

3.酶消化反应：取PCR 产物约2.0μl，加限制性内切酶BstN I1U，10×酶消化反应缓冲液1.0μl，蒸溜水补至10.0μl 置试验管中。37℃温箱中孵育4h。

4.酶切产物电泳分型：6%聚丙烯酰胺凝胶电泳（T=6%，C=3.3%，凝胶规格为82mm×64mm×0.75mm）。电极缓冲液为1×TBE。将加有1/5 体积上样缓冲液的酶切产物电泳，220 v 电压，电泳2——3h。

5.银染显色将凝胶剥离至染色盘中，用10%冰醋酸固定30min,去除固定液，用蒸馏水冲洗凝胶3 次（2min 以内）。将0.1%硝酸银溶液200ml 倒入染色盘中，染色30min，倒掉染色液，蒸馏水快速冲洗凝胶1 次（20s 以内）。显色液200ml（3%Na2CO3，含0.05%甲醛，2‰Na2S2O3）倒入染色盘中，不断震荡，直至谱带显示清晰。用固定液终止显色。蒸馏水洗涤一次，贴于滤纸上晾干保存。

注意事项

1.靶片段的扩增产物要纯，如有非特异产物（特别是大片段可能含有酶识别序列）将竞争酶活性，使样品消化不完全或及出现酶消化杂带；

2.酶消化过程要充分（即底物与酶的比例要合适，消化时间要保证），避免假阴性结果；

3.酶切阳性结果可以确定所检测具体序列，阴性结果仅可说明非酶识别序列，但不能准确判定具体序列。

4.酶识别序列如有甲基化之核苷酸将不被切割。

常见问题

1. 由于不同个体的等位基因之间的碱基之间的替换、重排、缺失等变化会导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。

2. 不同个体DNA的提取：（1）采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破损组织中的细胞；（2）用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；（3）用有机试剂（酚、氯仿）等抽提方法去除蛋白质。