甲基化 RNA 免疫共沉淀

甲基化 RNA 免疫共沉淀基于甲基化抗体特异性结合甲基化修饰的碱基，以磁珠包被的抗体结合修饰的 RNA，通过免疫结合，纯化富含甲基化修饰的 RNA。

mRNA 修饰，转录和翻译水平的调控。

无菌 1×PBS，检测试剂盒（Magna RIPTMKit, 12Reactions,  Millipore-MAGNARIP01）
，细胞，细胞计数器，RNase-free 管，Anti m6A 抗体 (EMD, MABE1006)，氯仿，无水乙醇。

使用 Magna RIPTMKit 进行 MeRIP 实验的操作步骤如下：

1、用预冷的无菌 1×PBS 清洗细胞，然后用胰酶消化后于 1 500 rpm 离心 5 min，收集细胞，再用 1×PBS 重悬清洗细胞并转移至 RNase-free 管中，对细胞进行计数（总 RNA 量约 300 μg，细胞数不少于 1×108）。

2、再次离心收集细胞沉淀，根据沉淀的体积，加入等量的 RIP Lysis Buffer，每 100 μL 的 RIP Lysis Buffer 加 0.5 μL Protease Inhibitor cocktail 和 0.25 μL RNase Inhibitor，将样品混匀，冰上放置 10 min，于 -80 ℃ 过夜以充分裂解细胞。

3、次日，于冰上使裂解液融化，并于 4 ℃、12 000 rpm 离心 10 min，转移上清至新的 1.5 mL RNase-free 管中。

4、Anti m6A 抗体与磁珠 Protein A/G 相结合

a．枪头轻轻吹打 ProteinA/G 磁珠使其悬浮分散，吸取 50 μL 体积的磁珠于 RNase free 管中，加入 500 μL 的 RIP Wash Buffer 混匀磁珠置于磁柱上，待磁珠吸附于管壁，弃上清，按此步骤清洗磁珠两次；

b．加入 100 μL RIP Wash Buffer 重新悬浮磁珠，并分别加入约 5 μg m6A 抗体和鼠 IgG 抗体，置于 DNA 混合仪上 10 转/分钟常温孵育 30 min；

c．将上述磁珠置于磁柱上，弃上清，吸取 500 μL RIP Wash Buffer 重新悬浮磁珠，置于磁柱上，待磁珠吸附于管壁，弃上清，按此步骤清洗磁珠两次；

5、Anti m6A 抗体与包含 m6A 位点的 circRNA/mRNA 相结合

a．加入 860 μL RIP Wash Buffer、35 μL 0.5 M EDTA 和 5 μL RNA 酶抑制剂混匀，重悬步骤 4 中的磁珠，吸取 100 μL 步骤 3 中的细胞裂解液上清至磁珠抗体复合物中，使免疫沉淀反应的终体积为 1 mL 并留存 10 μL 细胞裂解液于 RNase free 管作为 10% Input，存于 -80 ℃；

b．将上述 RIP 反应体系于 DNA 混合仪上 10 转/分钟 4 ℃ 孵育过夜；

c．将 RIP 反应液置于磁柱上，弃上清，加入 500 μL RIP Wash Buffer 重新悬浮磁珠，置于磁柱上，待磁珠吸附于管壁，弃上清，按此步骤清洗磁珠五次，最后使用预冷的 500 μL RIP Wash Buffer 重悬磁珠；

6、洗脱包含 m6A 位点的 circRNA/mRNA

a．将上一步的磁珠置于磁柱上，倒掉上清，加入 117 μL RIP Wash Buffer、15 μL 10% SDS 和 18 μL Proteinase K 混匀重悬磁珠；

b．将存于 -80 ℃ 的 Input 拿出融解，加入 107 μL RIP Wash Buffer、15 μL 10% SDS 和 18 μL Proteinase K，使终体积为 150 μL；

c．将上述所有 RNase-free 管置于 55 ℃ 振荡孵育 30 min，以消化蛋白质；

d．将 RNase-free 管置于磁柱上转移上清于新的 RNase-free 管中，并每管加入 250 μL RIP Wash Buffer；

7、纯化提取免疫沉淀 RNA

a．在上述液体中加入 400 μL 异戊醇：三氯甲烷：苯酚（体积比为 1:24:125），涡旋混匀 15 s 左右，然后 12 000 rpm，室温离心 10 min 以分离各相；

b．吸取上层液体加入 400 μL 三氯甲烷，涡旋 15 s 左右，12 000 rpm 室温离心 10 min；

c．取水相，每管加入 50 μL Salt Solution I、15 μL Salt SolutionII、5 μL Precipitate Enhancer，并加入 850 μL 无水乙醇混匀，于 -80 ℃ 过夜以达到沉淀 RNA 的目的；

d．解冻后于 4 ℃，12 000 rpm 离心 30 min，小心弃上清，80% 乙醇洗涤沉淀一次，然后于 4 ℃，12 000 rpm 离心 15 min，小心弃上清并晾干沉淀，加入 10~20 μL RNase-free Water；

8、将提取的 RNA 使用 NanoDrop 测浓度后进行反转录，后续进行 qRT-PCR。

细胞量要足够，否则RNA量太少；清洗磁珠次数不能过多或过少。

提取 RNA 浓度太低。