引物设计，PCR引物设计的基本原则是什么？

1、引物设计:pcr引物设计的基本原则有哪些

2、引物设计:引物设计原则是什么?

引物设计有3条基本原则： · · 关注微信公众号：挪车小黄码 · 官方免费领取：挪车码，车主双方虚拟号码，隐私保护，拒绝骚扰，违章查询，免费使用！--挪车电话 官网：https://www.nuoche.cc/ · ·

首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primerlength），产物长度（proctlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用?G值反映)。

形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（plexformationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。

一、引物与模板的序列要紧密互补。

二、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。

三、再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

3、引物设计:引物设计原则是什么？

引物设计原则是：

1、引物长度一般为15-，常用的为18-，但不能大于。

2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近。

3、引物所对应的模板序列的Tm值**在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到3’的下降形状也有利于引物与模板的结合。

4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且**值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在－6时只达到40%，－8时少于20%，－10时接近于0。

5、错配率一般不要超过，否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为以上，而在错误位点的引发效率为，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的。

4、引物设计:引物设计中的F、R表示什么?

正向引物，反向引物。

引物自身及引物之间不应存在互补序列。连续互补的碱基应该要少于4个。引物应使其G值不要太高，G值越大，则双链越稳定。

引物长度和GC含量要适中。引物长度大概为18~，但不应大于，引物过短会影响到扩增的特异性，太长的话其延伸温度将会大于74℃，不利Taq酶的催化反应。若扩增产物为4~5kb，引物**不要少于。

注意事项：

1、引物的长度一般为15-30?bp，常用的是18-27?(22)bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq?DNA聚合酶进行反应。?

2、碱基要随机分布：引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False?priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布**是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

3、3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

4、引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。