WB实验原理及流程图

一、Western blot实验原理

WB实验是Western Blotting的缩写，也称为免疫印迹实验，是一种用于检测特定蛋白质的方法。采用的是聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE) 电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式
吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的特异性抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该实验通常分为以下几个步骤：

蛋白质提取：从细胞或组织中提取蛋白质，通常使用一种称为RIPA缓冲液的提取缓冲液。

蛋白质分离：将提取的蛋白质通过电泳分离，常用的电泳方法包括SDS-PAGE和非变性PAGE。

转移：将分离的蛋白质通过电泳转移到聚合物膜上，通常使用的聚合物膜是聚丙烯酰胺凝胶膜或硝酸纤维素膜。

阻断：用一种称为“阻断液”的液体在聚合物膜上进行非特异性结合，防止非特异性的抗体结合到聚合物膜上。

一次抗体孵育：使用一种特异性抗体与目标蛋白质结合。

二次抗体孵育：使用一种标记有酶或荧光物质的二次抗体与一次抗体结合，以标记目标蛋白质。

检测：使用化学发光或荧光仪器检测荧光或酶反应，确定目标蛋白质的位置和数量。

二、以下是WB实验的流程图：

蛋白质提取 -> 蛋白质分离 -> 转移 -> 阻断 -> 一次抗体孵育 -> 二次抗体孵育 -> 检测