膜印记固相杂交法（固相杂交-Southern 印迹杂交）

原理

用途

试剂

DNA 提取液、SDS、蛋白酶 K、酚、氯仿、异戊醇、限制性核酸内切酶、稀盐酸、Whatman 3MM 滤纸、2xSSC、6xSSC，5xDenhardt 试剂，0.5％ SDS 及 100μg／ml 经变性的鲑精 DNA（salmonsperm DNA，ssDNA）或者 6xSSPE，5xDenhardt 试剂，0.5％SDS，100μg／ml 经变性的鲑精 DNA 及 50％甲酰胺

仪器：

1．基因组 DNA 的制备、酶切和电泳

真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都可以用来制备 DNA。提取 DNA 的一般原理是将分散好的真核生物组织细胞在含 SDS 和蛋白酶 K 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚、氯仿、异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到 DNA 溶液，并可将 DNA 溶液经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。取适量的基因组 DNA 样品，采用适当的限制性内切核酸酶进行酶切。酶切完全后进行琼脂糖凝胶电泳，在其中一孔内加入合适的 DNA 分子量标准参照物，以 5V／cm（电极长度）的电压降进行电泳，待指示剂电泳至凝胶前沿时终止。

电泳结束后，将 DNA 分子量标准参照物泳道的凝胶切下，EB 染色，观察电泳效果，并在凝胶旁放一标尺再照相；切除无用的凝胶部分，并切去凝胶的一角，以便于定位。

2．Southern 印迹转移前电泳胶的处理

将凝胶浸泡于适量的变性液中，置室温 1 小时，不间断地轻轻摇动。对于较大的 DNA 片段（如大于15kb），可在 DNA 变性前用稀盐酸（0.2mol／L HCI）对凝胶中的 DNA 进行脱嘌呤预处理 10 分钟，然后再用强碱溶液处理，使之降解成较小的片段，从而可提高其转移效率。但应注意稀盐酸脱嘌呤的时间不能过长，否则导致 DNA 片段过小，影响与杂交膜的结合能力，而且小片段 DNA 易于在转移过程中扩散而使杂交带模糊。凝胶经碱变性处理后用去离子水漂洗一次，随后浸泡于适量的中和液内 30 分钟，不间断地轻轻摇动，换新鲜中和液，继续处理 15 分钟。

3．DNA 的转移

根据实验条件，选用合适的转移方法，下面将以毛细管转移法为例介绍具体操作步骤。将一塑料或玻璃平台放在盛有足量的 20xSSC 的托盘内，剪2张适当大小的 Whatman 3MM 滤纸，在缓冲液中浸润后铺在平台上，滤纸的两端要完全浸没在溶液中，并注意排除滤纸与转移平台之间的气泡。然后将用 20xSSC 浸泡后的凝胶以加样孔面朝下平放在滤纸上，用封口膜将凝胶的四周围住，再将预先依次经去离子水、20xSSC 溶液浸湿（至少 5 分钟）的与凝胶大小一致的硝酸纤维素膜（或尼龙膜）平整地铺在凝胶上（见图 6-3）。取 2 张 Whatman 3MM滤纸（与杂交膜一样大小）在转移缓冲液中浸湿后，依次铺于杂交膜上，排除两者之间的气泡。再于滤纸上压足够量的与其大小相同的吸水纸，最后在上面放一个平板，上压约 500g 重物，室温转移 8～12 小时后，撤除转移装置，取出杂交膜。

4．膜上 DNA 分子的固定

为了满足后续杂交实验的要求，必须将转移后的 DNA 固定到杂交膜上。将晾干的硝酸纤维素膜或尼龙膜放在两张 3MM 滤纸中间，80℃ 干烤 2 小时。对于尼龙膜，可以采用紫外交联仪（254nm波长的紫外线）照射尼龙膜上结合有核酸的一面，使尼龙膜与核酸分子之间形成共价结合。对于湿润的尼龙膜总照射剂量参考值为 1.5J/c㎡，干燥的尼龙膜约为 0.15J/c㎡，建议进行预实验以大致确定杂交信号最强时的照射剂量。

5．膜的杂交

用标记的核酸探针与转移到固相支持物上的核酸片段进行杂交。杂交溶液中加有已标记和变性的单链核酸或寡核苷酸探针，在一定条件下与印迹转移后固定在固体支持物上的互补核酸单链退火形成双链杂交体。杂交前首先进行预杂交，目的是将杂交膜上的非特异性 DNA 结合位点封闭，减少与探针的非特异性吸附作用，降低杂交结果的本底。

配制实验所需的适量预杂交液：6xSSC，5xDenhardt 试剂，0.5％ SDS及 100μg/ml 经变性的鲑精DNA（salmonsperm DNA，ssDNA）；或者 6xSSPE，5xDenhardt 试剂，0.5％SDS，100μg/ml 经变性的鲑精DNA 及 50％ 甲酰胺。应用前者时预杂交温度为 65℃，应用后者时预杂交温度为 42℃。这两种预杂交液对杂交膜的封闭效果没有明显的差异，可以依实验条件的不同任选一种。预杂交液中的多种大分子物质如 ssDNA、牛血清白蛋白等与杂交膜表面及待测核酸分子中的非特异性大分子结合位点以疏水作用力或其他次级键的形式结合，从而封闭这些非特异性结合位点。

1．印迹所用的杂交膜必须用洁净的平头镊接触，切不可用手指接触，否则将影响杂交结果的背景；不要擦伤杂交膜的表面，否则可能引起较高的背景；搭建转移平台时，一旦膜与凝胶接触后，就不要轻易移动，以免凝胶中的 DNA 分子转移到膜上的不同部位。

2．电泳结束后，应该确定酶切是否完全、电泳分离效果是否良好、DNA 样品有无降解、DNA 带型是否清晰、有无拖尾现象和边缘是否模糊等，以及是否有因电场强度不均匀导致的 DNA 样品间的泳动速度不一致，各泳道中的 DNA 样品量是否一致等。

3．硝酸纤维素膜只能通过彻底干燥来进行固定。干燥后核酸与硝酸纤维素膜通过疏水作用力结合在一起，相互之间的结合力较弱。而对于尼龙膜，适度的紫外线照射可促进核酸分子中的部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成共价结合，但过度照射会使过多的碱基同尼龙膜结合而导致杂交信号的减弱。经过固定后的杂交膜在室温下可以保存几个月之久，如果要保存更长的时间，则应置于 4℃ 或室温下的干燥器中。

4．采用毛细管转移法进行核酸转移时，用石蜡封口膜覆盖凝胶周边无核酸样品的地方，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。未堆放得整齐的纸巾，易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流的短路是导致凝胶中核酸转移效率下降的主要原因。

5．常用的膜封闭物有两类：一类是变性的非特异性 DNA，如鲑精 DNA 或小牛胸腺 DNA；另一类是高分子化合物，它们可以封闭杂交膜上的非特异结合位点。较常用 Denhardt 溶液，也有人用脱脂奶粉代替，并取得了比较好的效果。

6．杂交体系的体积越小，效果越好。因为当溶液体积较小时，核酸重结合的动力学较快，因而探针需用量亦可减少。此外，在杂交过程中，应保证杂交膜始终覆盖有一层杂交液，如果多张滤膜同时杂交，建议不断摇动以防止滤膜互相黏附。为尽可能减少背景造成的种种问题，最好用少量的 DNA 和尽可能短的时间进行杂交。

7．硫酸葡聚糖（dextran sulfate，MW 500 000）能促进 DNA 链间的结合，其微粒的表面可吸附 DNA 探针分子，使 DNA 接触面积增大，有利于杂交反应的进行。在 10％硫酸葡聚糖存在时，杂交速度可提高 10～100 倍，但缺点是杂交背景加深，一般不主张使用。

8．如果没有杂交信号或者信号很弱，可能由下述几种情况之一引起：探针标记效率低或者加入的探针浓度太低；电泳中加入的 DNA 量太低或者发生了降解；探针的检测系统出现问题。

9．杂交膜上出现斑点可能是封闭液中封闭剂浓度过低或封闭缓冲液配制时间过长，不能封闭杂交膜上的非特异性位点。此外，使用非放射性标记的探针进行杂交时，有许多原因可引起斑点：检测抗体与杂交膜的非特异性结合、在胶片曝光时使用了不洁净托盘、外源性碱性磷酸酶或其他污染物引起底物 AMPPD 自动降解等。

10．泳道背景高。印迹的其余部分都相当清楚，只是泳道的背景较高，这种情况是由探针的非特异性所致，建议采用更为严格的洗膜条件（65～68℃和0.1xSSC）。

11．杂交膜的重复使用。结合了核酸样品的杂交膜与一种探针杂交后，经碱或热变性方法洗去探针后，还可再与其他探针进行多次杂交。由于尼龙膜与核酸的结合比较牢固，而且膜的强度比较高，适合于多轮杂交；而硝酸纤维素滤膜与核酸的结合较弱，而且膜的强度也比较低，一般不反复使用。另外，如果滤膜在保存过程中干燥，则探针将与滤膜发生不可逆性结合，不能够洗脱下来，因此在洗膜、放射自显影以及保存过程中，均应保持膜湿润，并密封在塑料袋中。