细胞原位杂交法（固相杂交-菌落/噬菌斑原位杂交）
简介菌落/噬菌斑原位杂交是一种在硝酸纤维素滤膜上原位裂解细菌菌落并将释放出来的 DNA 非共价结合于滤膜的方法。结合于滤膜上的 DNA 再与相应的放射性标记核酸
简介
菌落/噬菌斑原位杂交是一种在硝酸纤维素滤膜上原位裂解细菌菌落并将释放出来的 DNA 非共价结合于滤膜的方法。结合于滤膜上的 DNA 再与相应的放射性标记核酸探针杂交，根据杂交结果筛选含有目的 DNA 序列质粒的细菌菌落。菌落的原位杂交技术主要用于基因克隆以及基因文库的筛选，以期从大量细菌克隆中分离含有目的基因片段的阳性克隆。
原理
核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 的基本原理是以已知序列核酸作为特异性探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的一种方法。其主要包括用于基因克隆筛选的菌落原位杂交、检测基因在细胞内的表达与定位的原位杂交以及基因在染色体上定位的染色体原位杂交等。
用途
菌落的原位杂交技术主要用于基因克隆以及基因文库的筛选，以期从大量细菌克隆中分离含有目的基因片段的阳性克隆。
材料与仪器
试剂：
培养基、琼脂粉、NaOH、Tris-HCI
仪器：
培养箱、真空干燥仪、杂交仪、洗膜仪、紫外灯
步骤
菌落/噬菌斑原位杂交的基本过程可分为如下几步：
1．将在琼脂培养板上生长的细菌印迹到杂交膜上，并通过不对称标记确定膜与平板的相对位置。
2．用碱变性方法对菌落进行裂解。取一张保鲜膜并在其上加入 0.75ml 0.5mol／L NaOH，将含菌落的滤膜面朝上放置于液面上，使滤膜均匀浸湿并放置 2～3 分钟，然后用干纸巾吸渍滤膜后，再用 0.75ml 0.5mol／L NaOH 重复操作一次；
吸渍滤膜后，将滤膜转移到含 0.75ml 1mol／L Tris-HCI（pH 7.4）的保鲜膜上中和 5 分钟，并重复 1 次；
吸渍滤膜并转移至 0.75ml含1.75mol／L NaCl，0.5mol／L Tris-HCI （pH7.6）溶液的保鲜膜上放置 5 分钟；
吸渍滤膜后转移至一张干的滤纸上室温干燥 30～60 分钟，然后夹在 2 张滤纸中间，真空80℃ 烘烤 2 小时使菌落样品中的 DNA 固定在膜上；
转移、固定完成后，探针的标记、预杂交、杂交、洗膜以及探针的检测方法等均与前面所介绍的方法一致，可参照有关内容进行。
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