巨噬细胞极化实验步骤

免疫效应细胞在免疫反应中并非是表型单一的活化细胞，在局部微环境因素的影响下，活化的细胞分化成具有不同表型的亚细胞型。这些亚型细胞适应局部环境同时又是局部环境不可或缺的组份。它们分布不同，表型特征有别:表达不同的表面分子，分泌不同细胞因子，功能也不同。典型的例子是Th细胞的极化，而近年来人们逐渐发现活化巨噬细胞有类似现象，成熟巨噬细胞能在各种因素诱导下出现表型和功能分化，即极化现象。

1、原代巨噬细胞的获取：

（1）处死小鼠，用取骨镊和手术剪。剪开小鼠皮肤，取小鼠两条后腿并剔除骨上的肌肉，然后浸泡在含1%双抗的PBS中。

（2）在小鼠腿骨的一段剪一个小口，然后用5mL含1%双抗的PBS冲洗骨髓细胞。用1mL枪尖吸取冲洗的细胞液，100目滤膜过滤到新的离心管。然后300 xg，离心5分钟，去上清液。

（3）用1-5 mL红细胞裂解液重悬细胞，冰上裂解5 min（期间适当震荡一下），300 xg离心5分钟去上清液。再用PBS清洗一次，并计数细胞数目，取1*106个细胞铺6孔板每孔。

（4）用RMPI-1640完全培养基（10%胎牛血清，100x双抗，M-CSF：10 ng/mL，1:10000稀释原液）中培养。每两天换一次液，培养一周后诱导出巨噬细胞。采用CD11b、F4/80流式抗体进行染色验证。

2、巨噬细胞极化实验：

（1）取对数生长期，状态较好细胞（原代巨噬细胞或者RAW264.7细胞株）铺板每孔1*106个细胞。

（2）加入LPS（100ng/mL）、INF-γ（40ng/mL）诱导为M1型巨噬细胞；加入IL-4（100ng/mL）诱导为M2型巨噬细胞。细胞因子同培养基一起加入。

（3）诱导12小时后。收集细胞，提RNA，RT-PCR检测M1型关键标志物：TNF-a、iNOS；M2型标志物Arg-1的基因表达水平。

（4）或者收集细胞后，流式抗体染色M1型（染色抗体：CD11b、F4/80、CD86）；M2型巨噬细胞（抗体CD11b、F4/80、CD206）流式上机检测。