流式样本单细胞悬液的制备方法

想要流式的染色结果好，必须用单细胞悬液，细胞团和细胞碎片容易堵塞进样管。从固态组织样本中制备单细胞悬液需要借助机械分离和（或者）酶消化。操作条件和酶的选择等需要根据经验进行一定的调整。以下是将四种常见的流式样本制备成单细胞悬液的方法。

一：组织培养细胞

所需试剂器皿

1. Accutase酶 （联科生物 Cat#AT001）
2. 流式染色缓冲液（联科生物Cat#S1001）
3. 15或50mL离心管

实验步骤

1. 对于悬浮生长的细胞，将细胞转移至离心管中，进行计数和活力分析后进入第3步；
2. 对于贴壁生长的细胞系，我们推荐用Accutase酶将细胞从培养皿中消化下来并分离聚集细胞。将细胞转移至离心管中进行计数和活力分析后进入第3步（注意：Accutase酶会改变某些细胞的表面抗原表位）；
3. 离心后，将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2 × 107/mL。

二、淋巴组织细胞

一般来说机械分离淋巴组织足够将细胞释放为单细胞悬液。

所需试剂器皿

1. 60mm×15mm的组织培养皿
2. 3ml注射器
3. 细胞过滤器（尼龙滤网）
4. 流式染色缓冲液（联科生物Cat#S100）
5. 15或50ml离心管

实验步骤

1. 将获得的组织（脾脏、淋巴结、胸腺）放入到组织培养皿中，用3ml注射器活塞加压的方法把组织分散为单细胞悬液（或者可以在10ml流式染色缓冲液总用两片载玻片把组织压成糊状）；
2. 用10ml流式染色缓冲液收集细胞，并将细胞悬液通过过滤器以除去细胞团和细胞碎片。将悬液收集到离心管中；
3. 4℃，300-400g离心细胞悬液4-5min，去除上清液；
4. 重悬沉淀细胞并做计数和活力分析；
5. 重复步骤3后，将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2 × 107/ml。

三、非淋巴组织细胞

所需试剂器皿

1. 剪刀或手术刀片
2. PBS或其他合适的生理缓冲液
3. 60mm×15mm的组织培养皿
4. 3ml注射器
5. 细胞过滤器（尼龙滤网）
6. 流式染色缓冲液（联科生物Cat#S100）
7. 15或50ml离心管

实验步骤

1. 将组织用剪刀或手术刀片弄成2-4mm大小的碎块；
2. 加入用PBS稀释的适量的酶，最佳孵育的时间和温度参考所用酶的操作说明书（注意：酶的种类取决于组织的类型；
3. 用移液枪轻轻吹打分散细胞后，用过滤器过滤除去细胞团和碎片，收集细胞悬液至离心管中；
4. 4℃，300-400g离心细胞悬液4-5min，去除上清液；
5. 用PBS重悬细胞，去除多余的酶溶液；
6. 按步骤4的方法离心；
7. 重复步骤5和6；
8. 用流式染色缓冲液重悬细胞，并进行计数和活力分析；
9. 按步骤4的方法离心，将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2 × 107/ml。

从全血中分离PBMC

所需试剂器皿

1. PBS
2. Ficoll或者其他密度梯度分离液
3. 流式染色缓冲液（联科生物Cat#S100）
4. 15或50ml离心管

实验步骤

1. 将全血用PBS 1:1在锥形管中稀释；
2. 在稀释的样本上面加入等体积的Ficoll；
3. 1000g离心20min;
4. 将位于PBS和Ficoll层间的PBMC转移到一个新的管中；
5. 加入PBS清洗细胞；
6. 4℃，300-400g离心细胞悬液4-5min，去除上清液；
7. 用流式染色缓冲液重悬沉淀细胞并做计数和活力分析；
8. 重复步骤6后，将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2 × 107/ml。