免疫技术

绝赞二抗使用指南

2024-12-24 免疫技术加入收藏

前两天开会老板居然说我不知道抗原抗体结合的原理？？？怒而整理了这篇文章（笑）。我们常常会习惯性地使用一些（昂贵的）一抗，虽然压根没管上面的标识。但是如何选择合适

前两天开会老板居然说我不知道抗原抗体结合的原理？？？怒而整理了这篇文章（笑）。

我们常常会习惯性地使用一些（昂贵的）一抗，虽然压根没管上面的标识。但是如何选择合适的二抗呢？兔子，耗子，山羊该怎么选择？IgG是啥？IgM又是啥？轻链重链又是啥？都知道要把抗体画成一个Y字形，这又是为何？

我在逛抗体公司NOUVS的主页的时候^[1]发现了这份二抗使用手册《Secondary Antibody Handbook》，是我见过讲的最清楚作图最优美的一份使用手册。于是今天就分享给大家。我发现里面还有很多使用手册，比上实验课的时候讲的细致多了呢。。

二抗用于检测细胞或组织样本中的蛋白表达。它与抗原特异性一抗结合，二抗可检测目标蛋白中的高度特异性氨基酸序列。二抗对一抗的指定区域或区域的特异性允许多个二抗与单一一抗结合，放大信号并增加检测敏感性。在进行IP,WB,IHC,IF或者FLOW，ELISA等实验的过程中我们都会去思考如何选择合适的二抗。

一、抗体结构

抗体是由三个等大小区域组成的y形分子。一个柔性铰链连接抗体杆(Fc)到抗体的臂(Fab)。两个抗体的作用是结合抗原，而柄区决定抗体的同型和功能特性。每只手臂由一条重链和一条轻链组成。此外，这些重链和轻链由一个可变结构域(VL或VH)和一个恒定结构域(CL或CH)组成。重链和轻链的可变区域(V)在抗体之间不同，并赋予其同源抗原的抗体特异性。Fc柄几乎没有变化，但对与效应分子和细胞的相互作用是重要的。

二、二抗术语

Host Species 宿主物种:用来生产二抗的物种。

Format格式:二抗的结构样式。

Species Reactivity 物种反应性:二抗识别的物种。

Target ig靶免疫球蛋白:二抗靶向的免疫球蛋白类或亚类。

Specificity二抗特异性:二抗识别的免疫球蛋白靶区。

Label检测标签:附于二抗上的标签或偶联物。

二抗是一种针对免疫球蛋白(抗体)分子的抗体。在最佳条件下，在免疫分析(间接检测)中，二抗特异性结合一抗的种和类。注意，二抗不能直接与目标蛋白表位结合，也不能赋予目标表位特异性，这是由一抗决定的。二抗的标签则决定检测方法。二抗从用另一种抗体免疫的动物产生。免疫抗体的规格(例如，种、亚类、片段等)决定所产生的二抗的特异性。例如，兔子抗鼠药IgG2b (H+L)二抗由大鼠IgG2b免疫球蛋白分子重链和轻链免疫家兔产生。

二抗增加了检测的敏感性，因为多个二抗结合到一个一抗的能力(信号放大)。二抗的使用也为多重标记实验提供了更大的灵活性，因为市场上的二抗被预先标记在不同的标签上。

直接检测:针对目标物的单偶联抗体。

间接检测:未偶联一抗与偶联二抗结合使用。

1.二抗宿主物种（这是首要考虑的问题）

二抗应与一抗针对同一物种，但不是在同一物种中产生。例如，小鼠一抗需要在小鼠以外的任何物种(如兔、山羊、大鼠、驴等)中培养的抗小鼠二抗。

tips

在多次标记实验中，如果可能，所有二抗都应来自同一宿主物种。然而，所有的一抗都应该在独特的宿主物种中培养。这就允许使用针对一种一抗的种特异性二抗，从而限制二抗和其他种的一抗之间的交叉反应。
为了限制二抗与近缘种培养的一抗结合，使用对近缘种预吸附的二抗。例如，在多次标记实验中，一种抗小鼠二抗可能与一种大鼠一抗发生交叉反应。使用对大鼠吸附的抗小鼠二抗可减少交叉反应性。注:在考虑对近亲属物种(如大鼠和小鼠)预先吸附的二抗时，应给予谨慎。吸附可消除高亲和力抗体，导致信号减弱。
为了减少非特异性染色，减少背景信号，用同一宿主的血清作为二抗进行阻断。

2.二抗形式（我平时似乎很少考虑到这个问题）

二抗的形式是指二抗本身的结构。整个抗体可被胃蛋白酶裂解以消除抗体的Fc部分，产生F(ab’)2片段抗体:抗体的两个臂和铰链区。用巯基乙醇进一步裂解F(ab')2片段，去除F(ab')2片段的一个臂，产生一个F(ab')片段:抗体的一个臂和铰链区。注意，F(ab')片段在结构上与F(ab)片段不同:F(ab)片段是由整个免疫球蛋白的木瓜蛋白酶裂解形成的，缺乏F(ab')片段中存在的铰链区域。

注意:当考虑二抗时，重要的是不要混淆格式和特异性。考虑这个二抗:山羊F(ab') 2抗人IgG F(ab)二抗。第一个F(ab') 2标识为二抗格式，第二个F(ab)标识为二抗特异性。在这个例子中，二抗由F(ab') 2部分(格式)组成，并且对一抗的F(ab)区域有特异性(特异性)。

什么时候使用Fab片段二抗？

对Fc受体高表达的细胞进行染色

在白细胞群(如巨噬细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞等)细胞表面表达的Fc受体可与抗体s Fc部分结合，导致非特异性结合和背景信号增加。在对表达大量Fc受体的组织或细胞(如淋巴结、脾脏、外周血等)进行染色时，建议使用Fab片段二抗。二抗Fc部分的缺失消除了二抗与样品中表达的Fc受体的结合。

表达Fc受体的细胞或组织的F(ab’)2片段二抗染色

使用来自同一宿主物种的一抗进行双重标记

F(ab)片段二抗可与来自同一宿主种的两种一抗进行双重标记。由于每个F(ab)片段二抗只含有一个抗原结合位点(单价)，在随后的孵育过程中不能结合另一个分子(即双重标记时的第二一抗)。F(ab')2二抗是二价的(两个结合位点)，不推荐用于双重标记实验。在结合第一个一抗后，二价二抗的第二结合位点可能被空置。然后，这个未占据的结合位点能够结合第二个一抗，导致假阳性错误。

阻断内源免疫球蛋白

二抗与内源性免疫球蛋白结合可增加背景信号。样品用正常血清封闭后，用未共轭Fab (H+L)抗体孵育，会降低背景信号，增加特异性染色。

3.靶向免疫球蛋白

什么是抗体或免疫球蛋白类型?

抗体重链Fc部分的微小变化使抗体可分为五个独特的类别:IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。五个类的重链分别用对应的希腊字母表示:α, δ, ε, γ和 μ。此外，由于进一步的重链变异，可以将IgG和IgA同型分为亚类。与抗体重链不同,轻链λ和κ是所有类之间共享。然而，每个抗体只表达一个轻链或另一个，从不同时表达。

二抗类别和分型

一抗应该用哪种免疫球蛋白?

单克隆抗体:二抗应针对一抗的类或亚类。例如，小鼠IgM一抗需要抗小鼠IgM二抗。有时，一个特定的子类(例如人类IgG2, IgG1)可能会被推荐使用。在这种情况下，针对更一般类别(即抗人IgG)的二抗可以用于单一标记实验，因为大多数类特异性二抗可以识别单个亚类别。但在多次标记实验中，当使用多个亚类特异性一抗时，应使用亚类特异性二抗来区分一抗。例如，使用IgG2和IgG1一抗的多次染色实验需要使用抗IgG2和抗IgG1二抗。

多克隆抗体:当使用多克隆一抗，然后IgG二抗是推荐使用的，因为大多数多克隆抗体是IgG类免疫球蛋白。

4.二抗特异性

特异性是指一抗或免疫球蛋白被二抗识别的区域或链。这部分看了好几遍也不是看得太懂，可能需要实际运用的时候在考虑吧。

抗IgG (H+L):一种具有(H+L)标记的二抗，靶向IgG分子的重链和轻链(即Fc和Fab区域)。这些抗体也会与其他类(如IgE、IgD等)发生反应，因为这些类之间共享轻链。更广泛的表位识别(H+L)二抗使其适用于大多数需要二抗的免疫分析。

抗igg Fc片段或重链:与(H+L)二抗不同，以靶免疫球蛋白Fc区域或重链为靶点的二抗具有类特异性，不会与其他类免疫球蛋白发生反应。针对Fc片段的二抗被吸附在F(ab’)2片段上。如果打算在ip后进行western blot分析，建议使用重链特异性二抗来检测大于55kd或小于45kd的蛋白的表达。针对(H+L)区域的二抗将识别用于免疫沉淀的一抗的还原和变性重链(50 kDa)和轻链(25 kDa)。此外，Fab片段抗fc二抗可用于一抗在多次标记实验孵育前预标记。

抗IgG F(ab’)2片段:一种具有F(ab’)2标记的二抗，靶向于IgG一抗的F(ab’)2区。这些抗体被吸附在Fc片段上，但由于识别了F(ab)区域的共享轻链，它们会与其他类发生反应。

抗IgG轻链:一种轻链特异性二抗靶向IgG轻链(kappa或lambda)。这些抗体不与一抗重链反应，但识别其他免疫球蛋白类的共享轻链。例如，山羊抗人IgG Kappa轻链二抗不仅能识别IgG亚类，还能识别IgA、IgD、IgE、IgM等轻链。在ip后进行western blot分析时，建议使用轻链特异性二抗来检测大于30 kDa蛋白的表达。western blot分析中使用的A (H+L)特异性二抗将识别免疫沉淀步骤中使用的一抗的重链(50 kDa)和轻链(25 kDa)。使用轻链特异性二抗，去除50 kDa的重链带，可以清晰的检测到大于30 kDa的蛋白。

tips:

当一抗的子类未知时，推荐一种针对轻链的二抗。在这种情况下，最常用的是抗igg (H+L)二抗。
针对轻链的二抗可与任何类结合;所有的类都表达了轻链。

4.如何确定正确的标签

标签的选择取决于应用的手段。需要荧光检测的检测手段(如流式细胞术、免疫细胞化学、免疫荧光等)需要结合到荧光色素上的二抗。在设计每个实验时，应考虑每种荧光的激发光谱和发射光谱。常见的荧光染料包括FITC、PE、APC、DyLight AlexaFluor或Atto染料。酶检测需要结合HRP、碱性磷酸酶(AP)或生物素的二抗。亲和素和链霉亲和素结合生物素形成复合物的能力使信号扩增不依赖于二抗的宿主种类。由于过氧化物酶比AP更经济、更稳定，HRPs在化学发光检测系统中更受欢迎。然而，AP相对于HRP增强的敏感性使得AP在比色检测中更为常见。

三、二抗和预吸附:如何限制交叉反应