​RNA Dot Blot斑点杂交实操步骤

一、RNA乙酰化Dot Blot实操步骤

1、实验准备

仪器准备：超微量核酸分析仪、紫外交联仪、水平脱色摇床、化学发光仪、超净工作台、微量移液器、电热恒温鼓风干燥箱、-80℃超低温冰箱、移液器、台式高速冷冻离心机、反渗透超纯水机、立式圆形压力蒸汽灭菌锅

试剂准备：Trizol、氯仿、异丙醇、DEPC水、1.5 mL EP管、无水乙醇、尼龙膜(带正电荷)、BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)

2、实验步骤

（1）总RNA的提取

用NanoDrop方法检测mRNA的纯度，并稀释成不同的浓度。

（2）RNA Dot blotting

Step1：取出待测RNA样本，解冻后测量RNA浓度，全程冰上操作。

Step2：将样品浓度统一，并在新的无酶管连续稀释样品并混匀，稀释梯度不固定，可自己试试最好效果。我选择的终浓度为400/200/100μg/μL。

Step3：离心后，将RNA样品95℃加热3分钟以破坏二级结构，结束后立即冰上冷却，防止重新形成二级结构。

Step4：用1mL枪头粗端在NC膜上留下圆形印记，以引导加样，随后将NC膜裁剪成合适的尺寸，转移至干净的塑料盒中。

Step5：将2μLRNA样品按顺序滴在NC膜上，注意枪头不要碰膜，样品应在膜上自然扩散，每次加样都需要更换枪头。

Step6：室温下NC膜上稍干燥后可进行RNA与膜的交联。方法一：37℃烘箱30 min。方法二：254 nm波长的紫外线灯下照射30 h-1h。

Step7：10 mL TBST清洗膜5 min，洗去未结合的RNA。

Step8：弃去TBST，加入10 mL封闭液，室温摇动孵育1小时。

Step9：弃去封闭液，加入含有一抗的封闭液4℃孵育过夜。

Step10：10 mLTBST清洗膜3次，每次10 min。

Step11：二抗室温孵育1小时。

Step12：同第10步。

Step13：ECL底物孵育5 min

Step14：显影仪下拍照

Step15：拍完照后，将膜放置于10 mL亚甲蓝染色缓冲液中，室温摇动孵育30 min

Step16：用ddH2O清洗至背景大致干净即可，约30-60 s

Step17：白光成像采集亚甲蓝染色后的图像作为负载对照。