Dot blot斑点杂交实验原理与方法

斑点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Smart Blotter(Wealtec)、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。

Dot blot斑点杂交实验可分为DNA、RNA和完整细胞的斑点杂交三类，三种方法各有不同。

1、DNA斑点杂交方法介绍

（1）先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。

（2）将DNA样品溶于水或TE，煮沸5 min，冰中速冷。

（3）用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。（4）将膜烘干，密封保存备用。

2、RNA斑点杂交方法介绍

RNA斑点杂交法与DNA斑点杂交方法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5μl焦碳酸二乙酯（DEPC）水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。

3、完整细胞斑点杂交方法

应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。

Dot blot斑点杂交实验法简单实用，适用于大样本数同时进行检测，但是由于同一斑点位置，除了目标核酸分子外，还存在其他成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸分子有可能会与探针分子部分结合，促进探针分子与目标核酸分子的结合，可能导致阳性结果放大甚至是假阳性结果，分析检测结果是要结合实际考虑到这一点。