PCR检测支原体操作步骤

支原体因为个头小，能穿过0.22μm滤器，并且在实验室内会潜在的扩散。支原体污染细胞后，培养液不一定会发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。所以支原体感染会使培养的细胞慢慢枯萎，使得用被污染的细胞样本做的实验完全失去意义和价值。因此，有必要对新引进的细胞和实验过程中的细胞株进行支原体检测。

PCR法检测的实验原理是：原核生物的rRNA碱基序列非常保守，而rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区如16S和23S间隔区，各种生物种间的碱基序列差别很大。这个间隔区的DNA序列及长度在Mycoplasma各个种间既有相对保守的部分，也有具有很大差异的部分。本制品是在编码16S和23S rRNA的DNA上设计一对F1/R1引物，扩增编码16 S和23S rRNA的DNA间隔区。此反应体系只特异性扩增Mycoplasma DNA，检出灵敏度与特异性都很高。

PCR法检测支原体操作步骤如下：

1、支原体样品预处理

收集200 ul样品于PCR管中，12000rpm离心5分钟，去除上清液，加入30 ul纯水或者PBS重悬，然后将其置于95℃加热10分钟，冷却到12℃，最后8000rpm离心2分钟，上清液为样品备用。

2、支原引物检测

3、PCR检测

（1）将合成的引物稀释成终浓度为100 nmol/L的储藏液与10 nmol/L的工作液。

（2）配制PCR预混液。

（3）向以上反应混合液中加入检测样品（5ul以下），使总体积达到50ul。添加样本时应防止交叉污染。

（4）把反应管放入PCR仪中，设定以下条件，进行PCR反应。PCR的检测下限是M.capricolum 1ng，M.hyopneumoniae和U.urealyticum 100pg、其他的Mycoplasma是10pg。但是Human DNA、Mouse DNA在100 ng时有非特异性片段扩增。

（5）预先配置好1~1.5%的琼脂糖胶，将完成的PCR反应液依次加入到胶孔中并选择合适的Marker进行琼脂糖凝胶电泳。

4、实验注意事项

（1）PCR反应的前期操作应在无菌环境中进行。

（2）检测前，待测细胞要用无双抗培养基培养7d。