培养法检测支原体操作步骤

培养法为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。

（一）材料与设备

1.精氨酸肉汤培养基按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加20％胎牛血清）。

2.支原体琼脂培养基按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加20％胎牛血清）。

3.其他超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管／皿、37°C培养箱。

（二）操作步骤

1.样品的储存。样品取材后，最好尽快进行检测。样品如在24h以内进行支原体检测，可储存在2~8℃;如果超过24h样品应放置于－20℃以下保存。-20℃保存的样品，进行检测时需重新加入到对照培养细胞中，培养72h后，取上清直接进行接种检测。

2.准备12支精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基（半流体）。

3.将样品分别接种到10ml精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中（已冷却至36℃），每支培养基接种样品0.5~1.0ml，每种样品接种6支精氨酸肉汤培养基，3支半流体培养基。

4.接种6d后，取3支精氨酸肉汤培养基中样品0.5~1.0ml.复种于精氨酸肉汤培养基中。

5.36℃培养29d,每隔3d观察一次。记录实验结果。

（三）结果判断

培养结束时，精氨酸肉汤培养基分为6支接种，3支取出，3支复种。精氨酸肉汤培养基如有支原体生长，则液体颜色改变（粉色或黄色)。

半流体培养基中如有支原体生长，则出现絮状沉淀。