RNA pull-down实验问题答疑

1、RNA pull-down的实验如何防止RNA降解？

RNA pull-down实验的一大难点就是RNA本身易降解，所以过程中要禁止RNase，以防止降解。因此在整个实验过程中除了EP管、枪头、镊子这些常用的器具需要灭菌，所有试剂均需要DEPC·H2O配置并灭菌！处理后的耗材需要尽快用掉，超过两周则需要重新处理。操作台需要用RNaseZAP擦净，以去除环境中的RNA酶的影响。

2、RNA pull-down的实验如何防止RNA降解？

实验中RNA与蛋白结合的亲和力低怎么解决？

首先确定是不是①缓冲环境有没有优化、②裂解完不完全、③磁珠用量、④RNA探针用量这几个方面有问题，依次排除，如果都没有问题，就要考虑是不是RNA连接生物素的效率低的问题，如果是，那么：

(1)可能是RNA纯度不够，需要重新纯化

(2)RNA没有变性完全

(3)连接的时间短，建议连接时间不要少于4小时，必要时可以16℃过夜。

3、RNA pull-down后银染，条带背景深是什么原因？

考虑是不是SDS-PAGE染色时间过长或者抗体的质量问题，多克隆抗体经常会出现这种情况，最有可能的情况是样品中包含的非特异性蛋白太多了，针对这一点，有以下解决措施：

(1)优化孵育时间、温度、盐浓度等条件

(2)优化缓冲体系，使用严谨性高的缓冲体系

(3)提高裂解液的质量

电泳后看不到蛋白条带是不是就代表RNA与蛋白不互作？

也有可能是体外转录的RNA序列有问题；样品中蛋白质浓度过低同样难以观测到条带，当然还会存在实验操作失误的问题。

4、RNA pull-down实验前富集LncRNA都有哪些方法？

富集LncRNA问题其实也就是LncRNA如何被链霉亲和素识别以及如何带上生物素标记的问题，大致上有三种方法:

(1)探针法:

针对该LncRNA的序列，设计生物素标记的探针。此种方法最关键的是探针的特异性，所以最好用Northern Blot检测探针的特异性。可以结合内源的LncRNA是探针法的最大优势。缺点就是比较贵，需要的样品量大。

(2)生物素标记法:

在LncRNA的5‘端加上T7启动子，利用体外转录试剂盒，可以制备大量的LncRNA。再通过生物素标记试剂盒，就能得到大量的生物素标记的LncRNA。常用的折叠的方法退火，从95℃退火到4℃，大约30秒一度就可以了。

(3)TRSA法:

除了生物素，链霉亲和素还可以识别TRSA结构，因此在LncRNA的一端加上TRSA序列也是不错的选择。

5、RNA pull-down的实验有对照吗？

有，探针法和生物素标记法的对照都是相应的反义序列：探针的反义序列以及长非编码RNA的反义序列。TRSA法的对照是TRSA序列本身。