酵母双杂详细操作步骤

一、构建重组Activation Domain（AD）融合的重组质粒（pGADT7载体）以及Binding Domain（BD）融合的重组质粒（pGBKT7载体）；

二、双向酵母双杂交实验鉴定蛋白质间的相互作用

1、酵母转化中DNA混合液的配制

在制备酵母感受态的过程中配制下面的DNA转化混合液（1×）：

2、酵母感受态细胞的制备以及共转化，下面是所需用量为10个转化实验的酵母感受态细胞的制备。

（1）挑取平板上AH109酵母细胞的单个克隆至5 mL YPD培养基中，30℃，摇床振摇培养过夜（可加入2 mg/mL的Adenine 75μL使酵母生长速度加快）；

（2）转接2.5 mL过夜培养的菌液至50 mL YPD培养基中继续培养约3-4 h（OD600~2-4）；

（3）用50 mL的离心管收菌，4,500 rpm，3 min，弃上清；

（4）加入20 mL无菌水洗涤，同样条件离心，弃上清；

（5）用1 mL无菌水重悬菌液，转移至1.5 mL的EP管中；

（6）最高速短时离心15 Sec；弃上清；

（7）加入450μL LiAc(0.1 M)重悬菌体，30℃摇床振摇培养15 min；

（8）分装50μL/管至EP管中；

（9）最高速短时离心15 Sec；弃上清；

（10）每管加入已经配制好的DNA转化混合液（可加入40μL DMSO以提高转化效率），彻底重悬细胞，30℃摇床振摇培养45 min；

（11）转移至42℃水浴20 min；

（12）冰上放置3 min；

（13）最高速短时离心30 Sec；弃上清；

（14）加入100μL无菌水重悬菌体，涂布于SCM/-2(缺少色氨酸和亮氨酸的酵母合成培养基)氨基酸缺陷型平板上。30℃恒温箱倒置培养3天后观察菌落生长情况。

3、酵母双杂系统相互作用的筛选

（1）3天后，在转化后的平板上各挑取四个单菌落，分别划线于SCM/-2、SCM/-3(缺少色氨酸、亮氨酸和组氨酸的酵母合成培养基)和SCM/-4(缺少色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤的酵母合成培养基)氨基酸缺陷型平板上，30℃恒温箱倒置培养3天后观察菌落生长情况。

（2）如果菌落能在SCM/-4平板上正常生长，说明AD-fusion和BD-fusion两者之间有强的相互作用；如果不能在SCM-4平板上正常生长但是能在SCM/-3平板上正常生长，则有弱的相互作用；如果在SCM/-4和SCM/-3平板上均不能生长而只能在SCM/-2平板上生长，则无相互作用。