酵母双杂实验注意事项

1、如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎么办？

在某些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1mL的SD/–Trp，接着将重悬液平铺于5个100-mm的SD/–Trp平板，在30℃下温浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5mL0.5XYPDA刮下每块板上的克隆，并收集到一管中，这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。

2、如果诱饵蛋白存在自激活，该如何处理？

该蛋白很可能带有完整的AD区和BD区，是个完整的转录因子，可以将转录因子基因分成两部分分别进行文库筛选，然后重新检测其是否自激活，但要注意切割也有可能破坏蛋白之间的相互作用。

3、转化效率太低怎么办？

1)检测感受态细胞效率，标准操作规范。2)注意质粒使用量，检查仪器状态。3)重新配制新鲜培养基，并做对照转化。

4、如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎么办？

在某些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆1mL的SD/–Trp，接着将重悬液平铺于5个100-mm的SD/–Trp平板，在30下温浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5mL 0.5X YPDA刮下每块板上的克隆，并收集到一管中，这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。

5、杂交效率不高，该如何处理？

在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的、新鲜的克隆进行培养，经过离心和重悬后，再使用血球计对细胞进行计数。密度应该在1 x 109/mL。一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性，同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。