动物细胞传代培养详细步骤

动物细胞传代培养操作步骤如下：

1、观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。

2、加热PBS、versene、培养基，(提前做好)瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。

3、打开超净台(先开风机，后开照明)，用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。

4、取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。

5、取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。

6、用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。(加versene主要是为了将旧培养基洗去)。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。

7、打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。

8、将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min,收胰酶，打开PBS.之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞，别忘了用旧培养基中和。

9、取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后(细胞变圆，但不漂起)，用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。

10、吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。

11、细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。

12、擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。

13、吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。

那动物细胞传代培养时需要注意哪些注意事项呢？

1、严格保证无菌操作：细胞离体后非常脆弱，容易被细菌、真菌、支原体等感染，且细菌生存能力强，一般的细菌传一代只有十几分钟而细胞却需要好几天，培养基中的营养物质会被细菌消耗殆尽，而且细菌等在生长过程中分泌的毒性也会造成细胞的死亡，使传代失败。

2、控制消化时间：细胞消化过度会导致相当一部分细胞损伤和死亡，如果细胞团中都是死细胞，则不会贴壁；如果细胞团中仍存在有活力的细胞，就会贴壁造成局部细胞密度不均匀，该局部较快形成中央坏死细胞区，难以培养传代失败。

3、及时关注细胞生长状态：日常观察培养液的颜色与透明度、细胞形态变化、细胞污染的观察及防治、细胞生长状况。