动物细胞原代培养操作步骤

1、待培养细胞组织取材

颈椎脱臼法处死小白鼠，放在100ml的烧杯中用70%乙醇消毒3min。用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾(任意一种脏器)。

（1）将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1%新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。

（2）将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔

2、清洗组织

在盛有PBS缓冲液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后的脏器放入另一个盛有PBS的平皿中。

3、剪切组织

将肾、肝、脾剪成1mm3(剪成肉末状)大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。

4、消化组织

（1）在50 ml离心筒中加入0.25%胰蛋白酶溶液25ml在温暖的环境中或置于37°水浴摇床中轻轻摇动15 min，转速约为180r/min。

（2）让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50 ml的离心管中，该管内按照每10 ml上清加入Im小牛血清的比例加入生血清以灭活胰蛋白酶。(小牛血清在共用无菌操作台上取用)

（3）在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复以上1和2步骤。

5、制备单细胞悬液

（1）将混合的细胞悬液离心，1200 rpm，5 min，弃上清。

（2）将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200 rpm，5 min离心。

（3）用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止，然后再按照第一步进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打，制成细胞悬液。

6、细胞接种

（1）将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。

（2）用滤器过滤细胞培养液再悬沉淀，并使终体积为20 ml。

7、细胞培养

（1）在培养瓶外做好标记(标明所培养细胞的名称和时间)，

（2）置于CO₂的孵箱中培养，

（3）72h后即可观察。