直接测序法检测SNP详解——最常用的方法

一、样本基因组DNA的提取

1.取50 mL血样于离心管中，加PBS缓冲液至1.5 mL，轻轻地摇匀。冷冻离心机6500 rpm离心10 min，去掉上清液，保留沉淀物。重复洗2次。

2.向保留沉淀物的离心管中加入DNA提取液500 mL，15 mL的蛋白酶K，混匀放入55℃水浴锅中消化过夜。

3.将消化过夜的反应液冷却至室温，加入等体积冰冷的饱和酚溶液，盖紧离心管盖，缓慢地来回颠倒10 min（在冰上进行），形成均匀的乳浊液。

4.冷冻离心机12000 rpm离心10 min。

5.小心地吸取上层水相至新管，用等体积饱和酚再抽提一次。

6.用等体积的氯仿再抽提一次。

7.离心后再取上清液于另一离心管中，加入1∕10体积3mol/L的NaAc使终浓度达到0.3mol/L，并加2倍体积冷的无水乙醇，上下倒置混匀，置-20℃冰箱沉淀30-60 min。

8.冷冻离心机12000 rpm离心10 min，弃上清液。

9.加入500μl 70%冷乙醇小心洗涤沉淀。冷冻离心机6500 rpm离心5 min，弃上清，用干净的吸水纸或用吸头将管壁残留的乙醇去除，干燥10～15 min，不要等沉淀完全干燥，否则难以溶解。

10.沉淀于100μl超纯水中。

11.将提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳及浓度的测定。

二、SNP分型检测

1.引物的设计与合成

(1)查阅文献，参考文献中的引物，直接合成；

(2)根据SNP的位置找到其序列，设计引物并合成；

2.PCR扩增片段

(1)PCR扩增体系；

(2)PCR扩增程序；

(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

(4)A.测序法：对目的条带进行切胶回收纯化测序，根据测序结果统计分析各个样本下该SNP的基因型；

B.酶切法：一般这种方法都有文献支持，在前期可以确定好对应的内切酶。根据内切酶的反应体系将PCR产物进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。根据酶切条带来统计分析各个样本下该SNP的基因型。

三、SNP检测

1.引物的设计与合成

根据基因的序列设计扩增片段引物并合成。

2.PCR扩增片段

(1)PCR扩增体系：

(2)PCR扩增程序：

(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)将目的条带进行切胶回收纯化测序，将测序结果与NCBI库进行比对，找出各个样本目的基因突变的位置和形式，对结果进行汇总分析，计算某一种突变所占的百分比，根据结果找出关联性很强的几个突变位点，即为标签突变位点。将这些突变位点与NCBI中SNP库进行比对分析，找出新发现的突变位点，可用于后续的验证和研究。