EDU法检测细胞增殖操作

EdU可以说是一款革命性的细胞增殖状态检测方法与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比，EdU只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内更容易扩散，不需要严格的样品变性(酸解、热解、酶解)处理，有效地避免了样品损伤，有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，具有更高的灵敏度和更快的检测速度。

EDU检测细胞增殖实验详细操作步骤如下：

一、首先用EdU来标记细胞

细胞，如果使用其它类型的细胞，实验可能需要做调整。建议EdU起始浓度是10mM，或者根据细胞类型设置几个梯度预实验进行预实验，再进行正式实验。

1.在六孔板里的盖玻片上培养细胞，使其生长至所需密度后处理细胞;

2.用10mM EdU溶液在无血清培养基中制备2xEdU工作溶液;

3.预热2x EdU溶液，然后将2xEdU溶液添加到等体积含有实验细胞的培养基中，获得1xEdU溶液。例如，对于zui终浓度为10M的溶液，可用20MEdu注意：建议不要更换所有的培养基，因为这会影响细胞增殖速率;将处理好的细胞孵育12小时;孵育完成后立即进行下一步。

二、细胞固定和透化

1,孵育后除去培养基，并向每个含有盖玻片的孔中加入2.5mL含多聚甲醛的PBS，室温下孵育15分钟;

2.除去固定液，用2.5mLPBS洗涤孔中的细胞5分钟，重复三遍;

3.除去洗涤液，然后向前五个孔中加入2.5mL通透液，室温下孵育20分钟:

4.除去通透缓冲液，用2.5mLPBS洗涤每个孔中的细胞两次，除去洗涤液;

5.立即进入步骤C。

三、EdU检测

每孔使用100L反应混合物。反应混合物体积可根据实际情况进行调节，但必须按比例加入反应组分。

1.制备Click-iT反应混合物。注意要按表中列出的顺序添加成分，否则反应将无法得到zui佳效果。配置好的Click-iT反应混合物必须在15分钟内使用。

2.向每个玻片上加入100Click-iT反应混合物，室温下避光孵育30分钟;

3.除去反应混合物，用2.5 mLPBS洗涤每孔一次后，除去洗涤液;

可选择步骤:进行核染色(DAPl或Hoechst33342)或抗体标记

提示：在孵育过程中一定要避光。如不需要其它染色，孵育后请直接进行成像和分析