纯化的RNA的点杂交和狭线杂交
原理点杂交和狭线杂交技术（Kafatos et al. 1979) 用于在同一固相支持物（通常为带电荷的尼龙膜）上固定几种核酸样品，然后用合适的探针与已固定的样
原理
点杂交和狭线杂交技术（Kafatos et al. 1979) 用于在同一固相支持物（通常为带电荷的尼龙膜）上固定几种核酸样品，然后用合适的探针与已固定的样品杂交，并由此判断靶序列的浓度。通过估计样品点发射出 的信号的强度，与已知浓度的标准品信号强度 进行比较，确定待测样品中靶序列的量。
材料与仪器
RNA 检测样品、标准品和阴性对照 探针标记与变性
NaOH 预杂交液 RNA 变性液 SSC
印迹装置 绞链仪 带正电荷尼龙膜 厚印透纸 水浴锅
NaOH 预杂交液 RNA 变性液 SSC
印迹装置 绞链仪 带正电荷尼龙膜 厚印透纸 水浴锅
步骤
一、材料
1. 缓冲液与溶液
NaOH ( 10 mol/L)
预杂交液
RNA 变性液
0.1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)
0.1X SSC ( 含 1%SDS，m/V)
0.5X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)
1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)
2X SSC
20X SSC
2. 核酸与寡聚核甘酸
RNA 检测样品、标准品和阴性对照
3. 探针
探针标记与变性
4. 专用设备
印迹装置
绞链仪（如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-rad) 或真空炉、微波炉
带正电荷尼龙膜
厚印透纸（如 Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)
预热水浴锅到 68℃
二、方法
安装印迹装置
1. 切一张合适大小的带正电荷尼龙膜。用铅笔标上表示方向的记号。用水把膜简单弄湿，在 20X SSC 中室温泡 1 h。
2. 在膜浸泡期间，先用 0.1 mol/L NaOH 小心清洗印迹装置，再用无菌水洗干净。
3. 把两片厚滤纸用 20X SSC 浸湿，再放到真空器顶部。
4. 把样品槽插入装置的上部，把湿尼龙膜放在样品槽加样孔的底部，用吸管在膜的表面滚动以去除膜与装置夹层中的气泡。
5. 加紧夹板，连接真空管。
6. 加入 10X SSC 直至液面没过尼龙膜，关掉真空，再用 10X SSC 充满。
RNA 样品准备
7. 把每个 RNA 样品（溶解在 10 μl 水）分别与 30 μl RNA 变性液混合。
8. 65℃ 温育 5 min，然后在冰上冷却。
9. 向每个样品中加入等体积 20X SSC。
10. 轻轻向印迹装置中吸入 10XSSC，直到淹没尼龙膜。
RNA 样品的印迹和 RNA 在膜上的固定
11. 把所有样品轻轻加入狭线中，然后轻轻吸干膜。当所有样品都铺到膜上后，每个狭线用 1 ml 10XSSC 洗两次。
12. 当第二次洗膜完成后，继续轻轻吸干膜。
13. 取下膜，然后用紫外交联、烘烤或微波照射把 RNA 固定在膜上。
固定化 RNA 的杂交与洗膜
14. 把膜放入烤盘或杂交炉中，加入 10~20 ml 预杂交液 68℃ 温育 2 h。
15. 把已变性的放射性标记的探针直接加到预杂交液中。在适当的温度下继续温育 12~16 h。
16. 杂交完后从塑料袋中取出膜，然后尽可能快地把膜转移到室温下装有 100~200 mJ、1X SSC ( 0.1% SDS) 的塑料容器中。盖紧塑料容器，放到摇床上轻摇 10 min。
17. 把膜转移到另一个装有 100~200 ml 的、预热到 68℃ 的 0.5X SSC ( 含 0.1% SDS) 的塑料袋中，然后在此温度下轻摇 10 min。
18. 按步骤 17 重复洗膜两次，使总的洗膜次数达到三次。
19. 用滤纸吸干膜，在 -70℃ 条件下放射自显影 24~48 h ( Kodak XAR-5 或相当的胶片)。钨酸盐型的增感屏比旧式稀土型的效果更好。当然，磷光成像仪也可以用来成像。
1. 缓冲液与溶液
NaOH ( 10 mol/L)
预杂交液
RNA 变性液
0.1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)
0.1X SSC ( 含 1%SDS，m/V)
0.5X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)
1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)
2X SSC
20X SSC
2. 核酸与寡聚核甘酸
RNA 检测样品、标准品和阴性对照
3. 探针
探针标记与变性
4. 专用设备
印迹装置
绞链仪（如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-rad) 或真空炉、微波炉
带正电荷尼龙膜
厚印透纸（如 Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)
预热水浴锅到 68℃
二、方法
安装印迹装置
1. 切一张合适大小的带正电荷尼龙膜。用铅笔标上表示方向的记号。用水把膜简单弄湿，在 20X SSC 中室温泡 1 h。
2. 在膜浸泡期间，先用 0.1 mol/L NaOH 小心清洗印迹装置，再用无菌水洗干净。
3. 把两片厚滤纸用 20X SSC 浸湿，再放到真空器顶部。
4. 把样品槽插入装置的上部，把湿尼龙膜放在样品槽加样孔的底部，用吸管在膜的表面滚动以去除膜与装置夹层中的气泡。
5. 加紧夹板，连接真空管。
6. 加入 10X SSC 直至液面没过尼龙膜，关掉真空，再用 10X SSC 充满。
RNA 样品准备
7. 把每个 RNA 样品（溶解在 10 μl 水）分别与 30 μl RNA 变性液混合。
8. 65℃ 温育 5 min，然后在冰上冷却。
9. 向每个样品中加入等体积 20X SSC。
10. 轻轻向印迹装置中吸入 10XSSC，直到淹没尼龙膜。
RNA 样品的印迹和 RNA 在膜上的固定
11. 把所有样品轻轻加入狭线中，然后轻轻吸干膜。当所有样品都铺到膜上后，每个狭线用 1 ml 10XSSC 洗两次。
12. 当第二次洗膜完成后，继续轻轻吸干膜。
13. 取下膜，然后用紫外交联、烘烤或微波照射把 RNA 固定在膜上。
固定化 RNA 的杂交与洗膜
14. 把膜放入烤盘或杂交炉中，加入 10~20 ml 预杂交液 68℃ 温育 2 h。
15. 把已变性的放射性标记的探针直接加到预杂交液中。在适当的温度下继续温育 12~16 h。
16. 杂交完后从塑料袋中取出膜，然后尽可能快地把膜转移到室温下装有 100~200 mJ、1X SSC ( 0.1% SDS) 的塑料容器中。盖紧塑料容器，放到摇床上轻摇 10 min。
17. 把膜转移到另一个装有 100~200 ml 的、预热到 68℃ 的 0.5X SSC ( 含 0.1% SDS) 的塑料袋中，然后在此温度下轻摇 10 min。
18. 按步骤 17 重复洗膜两次，使总的洗膜次数达到三次。
19. 用滤纸吸干膜，在 -70℃ 条件下放射自显影 24~48 h ( Kodak XAR-5 或相当的胶片)。钨酸盐型的增感屏比旧式稀土型的效果更好。当然，磷光成像仪也可以用来成像。
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