免疫荧光实操注意事项汇总

那么免疫荧光有哪些注意事项呢？

1、组织分切后，应迅速置入冰壶，并立即送至恒温切片机内进行包埋切片。

2、如果不能马上切片，应将标本立即置入零下七十度的低温冰箱内以保持抗原活性，防止抗原的移位或丢失，但在低温冰箱内放置的时间不应超过两日。

3、供免疫荧光检查的组织，应避免接触任何固定液，特别是含有乙醇的固定液。

4、进行首次荧光抗体染色时，要做对照染色。

5、由于荧光容易淬灭，一般仅能维持几个小时，因此，荧光二抗应避光保存，即从加入荧光二抗以后的步骤中都要尽量避光操作，封片后应尽早照相。目前有市售的荧光增强剂，可使荧光在4℃保存1-2周仍不淬灭。

6、常用的荧光素有以下几种，绿色荧光：FITC、Alexa Fluor 488和GFP；红色荧光：TRITC、Cy3、Alexa Fluor 568&594和Mito Tracker Red；蓝色荧光：Hoechst、DAPI；黄色荧光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。

7、不同的荧光素激发的波长不同，因此，选用滤光片时要注意。一般紫外线的激发波长为334-365nm，蓝光的激发波长为435-490 nm，绿光的激发波长为546nm左右。

8、荧光显微镜应提前至少15 min打开汞灯预热。关闭30 min后方可再开启。

9、免疫荧光的组织要求很高，载玻片及盖玻片要干净无杂质。进行荧光染色时，需注意染液的pH、浓度和染色温度，还要避免对荧光有熄灭作用的物质的接触。组织和细胞也有自发荧光，如红细胞中的血红蛋白呈红色荧光，维生素A呈绿色自发性荧光等。