正常成熟破骨细胞原代培养

实验材料：

1. 细胞来源：新生大鼠或兔，妊娠6个月以内的引产胎儿等；

2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2；

3. 细胞支持物：薄骨片、盖玻片；

4. 培养液：199培养基、MEM或DMEM培养基均可，须补加15%—20%小牛血清、25mmol/L HEPES及青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml。

实验方法：

1. 薄骨片的制备：取新鲜牛股骨干的密质部分，沿骨纵轴用骨锯切割成大小约0.5cm×0.5CM、厚为0.1cm的小块，再用金刚砂轮磨成厚约10—50μm（以便在相差显微镜下观察）的薄骨片。

使用前用超声波清洗仪超声洗涤3次，每次约10min。然后依次浸泡在3个盛有含青霉素（1000IU/ml）、链霉素（1000μg/ml）、两性霉素B（3μg/ml）的抗生素溶液的小容器中，每次10—20min。最后可浸于盛有含抗生素的培养液的容器内，置4℃（短期）或-20℃（较长期）冰箱内保存备用；

2. 取生后3—5d的大鼠，拉颈处死后置于盛有75%酒精的容器中，消毒3—5min后，取出放入培养皿中；

3. 用手术剪剪开其四肢皮肤、肌肉，取股骨和胫骨等长骨，放入盛缓冲液的培养皿中。除去骨表面的软组织、骨膜以及软骨；

4. 将除去骨膜等多余组织后的长骨干部分清洗后，置于盛有少量培养液的培养皿中。用手术刀或手术剪纵行剖开骨干。用手术刀轻刮骨的内表面，同时用尖吸管不断吸取培养皿中的培养液，冲洗骨内表面多次，直至骨内表面变白为止；

5. 用吸管吸打上述含碎骨片及分离细胞的培养液2—5min左右，使附着于碎骨片上的破骨细胞分离脱落于培养液中。静置1—2min后，待碎骨片沉降，收集细胞悬液；

6. 将细胞悬液加入到预置有薄骨片或盖玻片的24孔培养板中，在37℃、5%CO2 培养箱中培养；

7. 培养30min左右，取出薄骨片或盖玻片用培养液冲洗以除去未附着的骨髓造血细胞。冲洗后，将薄骨片或盖玻片移入另一培养板中继续培养。