细胞/组织免疫荧光实验操作步骤

以某细胞样本为例：

一、准备免疫荧光所需的仪器与试剂：

CO2恒温培养箱、倒置荧光显微镜、离心机、超净工作台、DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、抗生素

二、细胞免疫荧光技术操作

1.在培养板中将已爬好细胞的玻片用生理盐水浸洗3次；

2.用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，生理盐水浸洗玻片3次；

3.0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透15 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；

4.生理盐水浸洗玻片3次，吸干生理盐水；

5.每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗，4℃孵育过夜；

6.加荧光二抗：生理盐水浸洗爬片3次，每次3 min，吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中37℃孵育1h，生理盐水浸洗3次。注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量避光操作；

7.复染核：滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，生理盐水4次洗去多余的DAPI；

8.在荧光显微镜下观察采集图像

以某组织样本为例：

一、准备免疫荧光所需的仪器与试剂：

生化培养箱、微波炉、生物组织摊烤片机、普通冰箱、盖玻片、载玻片、无水乙醇、3%双氧水、中性树胶、二甲苯、PBS缓冲粉、柠檬酸缓冲液

二、组织免疫荧光技术操作

1.60℃烤片30 min；

2.切片脱蜡至水：先将切片置于二甲苯中10 min，2次。然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇，每级放置5-10 min。再用蒸馏水浸洗5 min；

3.热修复抗原：将切片浸入柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）,微波炉高火加热8 min后拿出，冷却至室温。冷却后PBS（pH7.2~7.6）洗涤3 min x 3次；

4.加入3%H2O2，室温10分钟以灭活内源性酶。PBS冲洗3 min x 3次；

5.血清封闭：切片滴加血清放入湿盒中，室温20 min。甩干不洗；

6.孵育一抗：滴加适当稀释的一抗，对照组滴加等量PBS，4℃冰箱过夜；

7.加荧光二抗：PBS浸洗3次，每次3 min，吸干切片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中37℃孵育1h，PBS浸洗3次；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量避光操作；

8.复染核：滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBS 4次洗去多余的DAPI；

9.封片：防荧光淬灭封片剂封片、荧光显微镜观察。