EMSA实验详细操作步骤

1、EMSA实验前准备

（1）合理的实验方案

根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。

（2）样本制备

可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中需等量加入蛋白。

（3）探针制备

根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。

2、形成蛋白-探针复合物

（1）在0.5 mL离心管中按顺序将下列组份混匀：

蛋白样本（2-5μg）XμL

poly d(I-C)1μL

Binding Buffer2μL

Nuclease-Free ddH2OXμL

总体积9μl

（2）冰浴5 min后，加入1μ探针。（对照组加1ul对照探针）

（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30 min。

3、制备凝胶，电泳

（1）制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积）

5XTBE1 mL

30%Acrylamide/Bis2.2 mL

deionized,sterilewater6.62 mL

80%Glycerol80μL

10%AP90μL

TEMED10μL

总体积10 mL

（2）按标准步骤制备凝胶。

（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10 min，与电泳完毕后冲洗加样孔。

（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。

（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3 cm为止。（大约50-60 min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）

4、转膜

（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。

（2）按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。

（3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。（注意根据实际情况调整电压及时间）。

5、检测

（1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗。（注意整个检测过程避免膜干燥）

（2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭20 min。

（3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），室温震荡孵育45 min。（勿将酶标记物直接加到膜上）

（4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡1 0 min。

（5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5 min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，使底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）

（6）化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整）。