噬菌体DNA在滤膜上的杂交实验

通过用 32P 标记探针的原位杂交，可筛选携带有固定化 DNA 的滤膜，这些 DNA 来源于噬菌斑。该技术是强有力的、高度特异的和很灵敏的，能从数千个噬菌斑中鉴别出单一的重组子。

噬菌体 DNA 放射性标记探针
氯仿 预杂交液 SM SSPE
煮沸的水浴 玻璃（Pyrex ) 烘烤平皿或其他杂交器皿 胶水 培养箱 放射性墨 Whatman 3 MM 纸

一、材料

1. 缓冲液和溶液

氯仿

预杂交液

SM

2X SSPE

洗液 1（2X SSC，0.1% (m/V) SDS）

洗液 2（1X SSC，0.1% (m/V) SDS）

洗液 3（0.1X SSC，0.1% (m/V) SDS）

2. 核酸和寡核苷酸

固定于膜上的噬菌体 DNA

放射性标记探针

3. 专用设备

煮沸的水浴（用于双链探针变性）

玻璃（Pyrex ) 烘烤平皿或其他杂交器皿



胶水，水溶性（如 FaberCastell 公司的 UHU Stic)

预置于适宜杂交温度的培养箱

放射性墨

Whatman 3 MM 纸

二、方法

1. 如果滤膜是干的，将经烘烤或交联的滤膜漂浮在 2X SSPE 表面，直到自下而上完全湿透，再将滤膜浸没 5 min。

2. 将滤膜转移至含有预杂交液的 Pyrex 平皿或其他杂交器皿中，每张 82 mm 滤膜用 3 ml 预杂交液或每张 132 mm 滤膜用 5 ml 预杂交液。将滤膜置摇床中于适宜的温度下（即在水溶液中杂交为 68℃，在 50% 的甲酰胺溶液中杂交则为 42℃）温和地振摇 1~2 h 或更长。

3. 通过 100℃ 加热 5 min 变性 32P 标记的双链探针，然后置冰水浴快速冷却，而单链探针不需要变性。



4. 将变性探针加入至浸泡了滤膜的预杂交液中，在适宜的温度下温育 12~16 h。

5. 当杂交完成后，将滤膜快速从杂交液中取出，立即浸入放置于室温的大体积（300~500 ml ) 洗液 1 中。轻轻晃动滤膜，且在清洗过程至少翻动一次。5 min 后，转移至新鲜的洗液中，继续轻轻晃动。再重复漂洗过程两次。

6. 在 68℃ 于 300~500 ml 的洗液 2 中漂洗两次，时间为 1~1.5 h。

7. 将滤膜置于 Whatman 3 MM 滤纸或纸巾上，在室温风干。在滤膜的背面贴上水溶性胶水，然后排列在一张干净、干燥、平整的 3 MM 滤纸上（编号的一面朝上），并用力压滤膜，使其粘在滤纸上而无法移动。在 3 MM 滤纸上选数个非对称的点，滴上放射性墨汁或化学发光标记。这些标记被用于对齐放射自显影与滤膜。用 Saran 公司的包装膜（Wrap/Cling Film) 盖住滤膜和标记。用胶带将包装膜在 3 MM 滤纸的背面封住，将滤纸上的包装膜拉直，防止起皱。

8. 将滤膜进行 X 射线片（Kodak 公司 XAR-2、XAR-5 或相当产品）曝光，带增感屏 -70℃ 曝光 12~16 h。

9. 将 X 射线片显影，根据放射性墨汁或化学发光标记与滤膜对齐，然后用非放射性的红色纤维尖头笔在 X 射线片的相应位置标上对应于编号滤膜的非对称性点。

10. 通过与琼脂平板上方向标记的比对找到阳性克隆。

11. 挑取阳性克隆，并保存于含 1 滴（50 μl ) 氯仿的 1 ml SM 中。

12. 为了纯化杂交阳性的噬菌斑，将从扣取琼脂块上回收到的噬菌体组分（通常为 50 μl 10-2 稀释液）铺平板培养，随后进行新一轮的杂交筛选。