用噬菌粒载体制备单链DNA

噬菌粒巧妙地组合了质粒和丝状噬菌体的特征。除了基本特征外，这些质粒通常是高拷贝数的，并带有一个修饰后的丝状噬菌体的主要基因间区。这个区域 ( 野生型为 508 bp)不表达蛋白，但含有全部的顺式作用序列，该作用是病毒 DNA 合成起始和结束及噬菌体颗粒的形态发生必不可少的。

大肠杆菌 F' 菌株 大肠杆菌 DH11S
卡那霉素 SDS 溶液 蔗糖凝胶加样缓冲液
琼脂糖凝胶 M9 基本培养基平板 YT 琼脂平板 水浴

一、材料

1. 缓冲液和溶液

卡那霉素（10 mg/ml)

SDS 溶液（2%，m/V）

蔗糖凝胶加样缓冲液

2. 凝胶

琼脂糖凝胶（0.7%) 悬于 0.5 X TBE, 含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

3. 培养基

加富的 M9 基本培养基平板

含 60 μg/ml 氨苄青霉素的 YT 琼脂平板

2 X YT 培养基

含 60 μg/ml 氨芐青霉素的 2 X YT 培养基

含 25 μg/ml 卡那霉素的 2 X YT 培养基

4. 专用设备

水浴，调至 65℃

5. 载体和菌株

噬菌体 M13K07 ( 辅助）

大肠杆菌 F' 菌株

大肠杆菌 DH11S

大肠杆菌 DH11S，用 M13 噬菌体的噬菌粒载体转化

大肠杆菌 DH11S，用带有外源 DNA 的 M13 噬菌体的重组噬菌粒载体转化

二、方法

高滴度辅助噬菌体原种的制备

成功使用噬菌粒的关键是制备已知精确滴度的辅助噬菌体原种。

1. 从加富的基本琼脂平板上挑取一个大肠杆菌 DH11S 的新鲜单菌落，接种 20 ml 2 X YT 培养基，温和揺动，37℃ 培养至 OD600 达 0.8。

2. 用 2 X YT 培养基制备一系列 10 倍稀释的 M13K07 噬菌体，将稀释的噬菌体铺板，以获得在 DH11S 细胞层中良好分离的噬菌斑。

3. 挑取分离良好的单个噬菌斑接种于装有 2~3 ml 含 25 μg/ml 卡那霉素的 2 X YT 培养基的 15 ml 培养管中。温和摇动（250 r/min), 37℃ 培养 12~16 h。

重要：以下步骤使用从单个新鲜挑取的噬菌斑获得的 M13K07 原种。

4. 将感染上清转移至 1.5 ml 无菌微量离心管，在微量离心机上，以最大转速，4℃ 离心 2 min。上清转移至新管中 4℃ 保存。

5. 采用在一株支持 M13 噬菌体生长的大肠杆菌 F' 菌株（TGI、DH11S、NM522 或 XLl-Bkie) 中形成噬菌斑的方法，测定每个噬菌体原种的滴度。

原种的感染噬菌体颗粒滴度应为 1010 pfu/ml。弃去所有低滴度的原种。

用辅助噬菌体增殖重组噬菌粒

6. 在两块含有 60 μg/ml 氨苄青霉素的 YT 琼脂平板上，取重组噬菌粒转化的和空噬菌粒转化的 DH11S 菌划线，37℃ 培养 16 h。

7. 挑取数个重组噬菌粒转化克隆和 1~2 个其亲本载体转化的克隆，接种至装有 2~3 ml 含 60 μg/ml 氨苄青霉素的 2 X YT 培养基的 15 ml 培养管中。

由于影响单链 DNA 得率的因素难以确定，应从每个噬菌粒重组体中挑取多个克隆，难以提高成功率。

8. 在每个培养管中加入 M13K07 辅助噬菌体至浓度为 2 X 107 pfu/ml。剧烈振荡 ( 300 r/min) 37℃ 培养 1.0~1.5 h。

在这种短时间培养后，细菌培养液应只是略浑，如果生长过旺，用预热的 2 X YT 培养基稀释培养物，直至浑浊恰能看见。




9. 在培养物中加入卡那霉素至终浓度为 25 μg/ml，37℃ 14~18 h。

由于噬菌体 M13K07 含有一个卡那霉素抗性基因，因而在这一步加入抗生素后，只有那些被感染了的细菌才能存活。

其他辅助噬菌体（如 R408 ) 不带抗生素抗性标记。在加入抗生素前应检査辅助噬菌体的基因型。

10. 将菌悬液转移至微量离心管，在微量离心机上，以最大转速，室温离心 5 min, 分离菌体和培养基，将上清转移至新管中 4℃ 保存。

用凝胶电泳估计噬菌粒单链 DNA 的得率

11. 在 0.5 ml 微量离心管中分别加入 40 μl 上清与 2 μl 2% SDS, 轻拍管壁混合内容物，65℃ 温育 5 min。

估计含噬菌粒单链拷贝的病毒颗粒的得率。先将上清稀释后感染大肠杆菌 DH11S，然后铺于含氨芐青霉素（60 μg/ml）的 YT 琼脂平板。根据 37℃ 培养 24 h 后产生的氨芐青霉素抗性克隆数，计算上清中含噬菌粒单链 DNA 的病毒颗粒数，含 2 X 1011~ 5 X 1011 pfu/ml 的上清可以获得满意的纯化噬菌粒单链 DNA 得率。

12. 在每个噬菌粒 DNA 样品中加入 5 μl 加样缓冲液，混合后加至 0.7% 琼脂糖凝胶的加样孔。

13. 6 V/cm 电泳数小时，至溴酚蓝迁移至胶的大约一半。在紫外线下检査和照相。

得率随噬菌粒上外源 DNA 的大小和持性的不同而不同。但通常为约 1 μg/ml 培养物。

14. 从含大置单链 DNA 的上清中分离噬菌粒单链 DNA。按方案“M13 噬菌体单链 DNA 的制备”的步骤进行，将体积放大 2~3 倍。

噬菌粒和 M13 噬菌体载体一样，随外源 DNA 的大小和特性不同，其单链 DNA 的得率可以差五至十倍。 通常片段越大，得率越低。而且，即使外源 DNA 大小相同，其单链 DNA 的得率也可以有很大变化，如，大多数酵母 DNA 片段对噬菌粒的增殖，似乎没有问题，然而同样大小的人基因组 DNA 可能使单链 DNA 的得率令人失望。噬菌粒上外源 DNA 的插入方向和噬菌体 DNA 复制起点的方向也会对得率产生重要影响。因此，用相反方向重新克隆片段或换用噬菌体 DNA 复制起点方向相反的载体有时可以解决得率低的问题。