DNA 的琼脂糖凝胶电泳实验

DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理是利用DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时具有的电荷效应和分子筛效应。

电荷效应是指DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电，在电场中向正极移动，且相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，能以相同速率移动。通常，DNA泳动速率随DNA片段长度的增加而减少，与电场强度成正比。

分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时收到较大阻力，依此分离不同大小的DNA片段。一般，DNA琼脂糖凝胶电泳可分离50bp到百万bp长度的DNA片段，视实际需求配制不同浓度和构型的琼脂糖凝胶。

常见问题原因分析

1. 跑出的DNA带模糊？

（1）DNA降解：避免核酸酶污染。

（2）电泳缓冲液不新鲜：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。

（3）所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；巨大DNA链电泳，温度应<15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。

（4）DNA上样量过多：减少凝胶中的DNA上样量。

（5）DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

（6）有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。

（7）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

2. 有不规则DNA带迁移？

（1）对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。

（2）电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；经常更换电泳缓冲液。

（3）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

3. 跑出的DNA条带弱或无条带？

（1）DNA的上样量不够：增加DNA的上样量。

（2）DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。

（3）DNA走出凝胶：正确连接电极方向避免插反的情况，缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。

（4）所用光源不合适：对于用EB染色的DNA应用短波长（254nm）紫外光源。

4. 跑出的DNA带缺失不完整？

（1）如果是小DNA带，可能跑出凝胶，可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。

（2）分子大小相近的DNA带不易分辨，应延长电泳时间，并核准正确的凝胶浓度。

（3）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。