NaCl离心法去除质粒DNA制备物中的小片段核酸

常规的质粒 DNA 制备物中都会不同程度地污染有来自宿主菌基因组或质粒断裂碎片的小分子 DNA 或 RNA。尽管它们的分子质量不大，但数量多，会对制备物中 DNA 片段 3' 和 5' 端的总量产生明显影响。

乙醇 NaCl 乙酸钠 TE 胰 RNase
Beckman SW 50.1 转子

一、材料

1. 缓冲液和溶剂

乙醇，NaCl（1 mol/L，用 TE ( pH 8.0 )配制），乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2 )，TE ( pH 8.0)。

2. 酶和缓冲液

无 DNase 的胰 RNase

3. 核酸和寡核苷酸

DNA 样品，CsCl 密度梯度离心纯化

4. 离心机和转子

Beckman SW 50.1 转子或可适用相应离心管的替代转子， Sorvsll SS-34 转子或性能相同的替代转子

二、方法

1. 测定质粒制备物体积。加入 0.1 倍体积的 3 moI/L 乙酸钠（pH 5.2 ) 和 2 倍体积的乙醇，混匀后于 4℃ 放置 30 min。

2. 于 4℃ 用大于 10000 g ( 转速大于 9100 r/min 时用 Sorvall SS-34 转子）离心 15 min, 回收核酸沉淀，尽可能去掉上清液，然后打开管口，在工作台上放置几分钟，使最后残留的微量乙醇蒸发殆尽。

3. 用 0.5~1 ml TE ( pH 8.0）溶解潮湿的 DNA 沉淀。

质粒 DNA 浓度应不少于 100 μg/ml。

4. 加无 DNase 的 RNase 至终浓度为 10 μg/ml，室温温育 1 h。

5. 准备一个 Beckman SW 50.1 离心管（或相当的离心管）加入 4 ml 含 1 mol/L NaCl 的 TE ( pH 8.0)，用带有一次性吸头的自动移液器在 1 mol/L NaCl 溶液上部加铺一层 1 ml 经 RNA 酶处理过的质粒 DNA 样品。必要时，可酌情用 TE ( pH 8.0 ) 充满离心管。

6. 于 20℃ 用大于 150000 g（转速大于 40000 r/min 时，用 Beckman SW50.1 转子）离心 6 h, 小心去掉上清液。

质粒 DNA 沉淀在管底，而寡核苷酸和小片段 DNA 留在上清中。

7. 用 0.5 ml TE ( pH 8.0）重新溶解质粒 DNA 沉淀，加 50 μl 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2), 将 DNA 溶液转移到微量离心管中。

8. 加 2 倍体积的乙醇，于 4℃ 放置 10 min, 沉淀 DNA。然后于 4℃ 以大于 10000 g 离心 15 min, 尽量去尽上清液，打开管口，放置在工作台上放置几分钟，让最后残留的痕量乙醇蒸发殆尽。

9. 用 TE ( pH 8.0 ) 溶解潮湿的质粒 DNA 沉淀。