质粒 DNA 提取实验（SDS碱裂解法（试剂盒提取））

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
 

简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

一、试剂盒组成、贮存、稳定性
 

耗材：DNA 制备管，2 ml 离心管，1.5 ml 离心管。
 

RNase A：50 mg/ml，室温保存。
 

Buffer S1：细菌悬浮液。加入RNase A 后，4℃ 贮存。
 

Buffer S2： 细菌裂解液，室温密闭贮存。(若出现沉淀，应于37℃温浴溶解并冷却至室温后再使用。）
 

Buffer S3：中和液，室温密闭贮存。
 

Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
 

Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
 

Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。

二、实验准备
 

1.  第一次使用前，RNase A全部加入Buffer S1 中，4℃贮存。
 

2.  准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。
 

3.  第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。
 

三、操作步骤
 

1.  取1-4 ml 在LB 培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），12 000xg 离心1 min，弃尽上清。
 

2.  用250 ul 已加入RNase A 的Buffer S1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。
 

3.  加入250 ul Buffer S2，温和并充分地上下翻转混合4-6 次均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min。
 

4.  加入350 ul Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8 次，12 000xg 离心10 min。
 

步骤5～7 可以选择负压法或离心法纯化质粒DNA。
 

A.  负压法

5A.  将质粒DNA 制备管插到负压装置的接口上。吸取步骤4 中的离心上清并转移到制备管中，开启并调节负压至-20-30 英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。
 

6A.  加500 ul Buffer W1，吸尽管中溶液。
 

7A.  加700 ul Buffer W2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700 ul Buffer W2 洗涤一次。
 

~undefined 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 

B. 离心法
 

5B.  吸取步骤4 中的离心上清并转移到DNA 制备管（置于2 ml 离心管中），12 000xg 离心1 min。
 

6B.  将制备管置回离心管，加500 ul Buffer W1，12 000xg 离心1 min，弃滤液。
 

7B.  将制备管置回离心管，加700 ul Buffer W2，12 000xg 离心1 min， 弃滤液；以同样的方法再用700 ul Buffer W2 洗涤一次。弃滤液。
 

~undefined 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 

8.  将制备管置回2 ml 离心管中，12 000xg 离心1 min。
 

9.  将制备管移入新的1.5 ml 离心管中，在DNA 制备膜正中央加60-80 ul 水或Eluent，室温静置1 min。12 000xg 离心1 min。