基 于 S N V 载体体系的反转录病毒的生成以及它们在各种细胞类型转导中的应用 材料

基 于 S N V 载体体系的反转录病毒的生成以及它们在各种细胞类型转导中的应用

材料

试剂

氯 化 钙（CaCl2) (2mol/L)

溶 解 14. 7 g CaCl2 于 IOOml H2O 中。过滤除菌或高压灭菌。

转染的细胞系： 293T 和 D17 (ATCC)

甘 油（1 0 % 〜2 0 % ) (合适的）

H ank 平衡盐溶液（HBSS)

2 X H E P E 缓 冲 液（HBS: 280m m ol/LN aCl、 1 0 m m o l/L K C l 、 1.5Imnol/LNa2 H P 0 4< ! > 、 12m m ol/L 葡萄糖、 50m m ol/LH EPES， pH 7.5)

LacZ 染 色 试 剂（Chemicon)

培养基

完全培养基： D M E M 培养基含 1 0 % 胎牛血清 F C S (293T 细胞）或 F B S (D 17细胞）、 1 % 青-I S 霉素、 1 % 谷氨酸

无血清培养基，含 1 % 青链霉素、 1 % 谷氨酸

磷酸盐缓冲液（P B S ) (合适的,•若操作甘油休克则需要）

无核酸酶水

用于生成反转录病毒的质粒

编码病毒包被蛋白的质粒

含有目的基因的基因转移载体

编码 E n v 蛋白的质粒

基于 SNV 和 REV-A 的病毒被表达特异性针对人类细胞表面受体的靶向配体的 VSV-G或其他 Env 包被蛋白假型。用作转染的质粒 DNA 的质量对于生成高滴度的反转录病毒载体是至关重要的。它应该是超纯的，应避免任何化学污染物， RNA 或蛋白质。我们建议用于反转录病毒颗粒生成的纯化的 DNA 的 A2m :A28。值大于 1. 8。

聚凝胺

Transfenctam 试 剂（P r o m e g a ) (合适的）

仪器

细胞培养皿 [ I O O m m (或采用利于多次转染的 12 孔 或 2 4 孔板）和 6 孔板]

离 心 管（15m l )

滤器：乙酸或聚磺酸纤维素（结合小分子蛋白质）， 〇.45um 滤膜

孵箱，预设到 37°C

小 离 心 管（1.5m l ，灭菌的）

显微镜

移 液 管（1.0m l 或巴斯德吸管）

摇床

超速离心机（B e c k m a n )， S W 41 转头

方法

细胞的准备

1.转染前 24 h，用完全培养基种植 293T 或 D 17 细胞在 IOOmm 平板中，过夜生长。种植 密 度 决 定 于 细 胞 的 增 殖 能 力 。一 般 来 说 ， IOOmm 的 平 板 种 植 0.5 X IO6 〜0.8X 106。

2.观察细胞密度， ‘汇合度应为 7 5 % 〜8 0 % 。用 I O m l 新鲜的完全培养基替换原培养基。孵 育 4 —— 6 h 。

细胞汇合度在获得最佳的病毒滴度中起主要作用。

转染

此方法适用于 IOOmm 细胞培养板。 D N A 的转染量应随着用于转染的培养板的大
小而变化。试 剂（CaCl2、 2 X H E P E 缓冲液、无核酸酶水）可以自制或购买（如 Prom e g a 的 ProFection M a m m a l i a n Transfection S y s t e m- C a P O 4)

3.对每个 I O O m m 平板，向已灭菌的 I.5m l 小离心管中加人 0 •5m l 2 X H E P E S 缓冲液，标记为管 1。

对于多个转染，用 12 或 2 4 孔板来准备转染混合物更简单。

4.另一管标记为管 2 , 加 人 IOug G a g -P o l 包被质粒， 4〜 5 啤 E nv ( V S V G 或 S N V 野生型）包被质粒和 1 〇鸿转染载体。质粒 D N A 的总量不应超过 30 ug 。 加 人 62ul 2m ol/LCaCl2 和足量的无核酸酶水，使总体积达到〇 . 5 m l。

5 . 用 I. O m l 移液管或巴斯德吸管将管 2 中的混合物逐滴加人管 1 中并用力吸打。或者在加人管 2 的过程中振荡管 1。最终溶液将生成沉淀，沉淀呈乳白色。
6 . 室温下放置混合物 2 0 〜 30m in 。

7.用吸液管上下吹打或振荡使沉淀混合均匀。

8 . 加 I m l 悬液和 5m l 无血清培养基到含 2 9 3 T 或 D 1 7 细胞的平板中。逐滴缓慢地加人混合悬液并轻柔漩涡。

9.37°C 孵 育 4〜6 h 。用 含 l 〇%F C S 的新鲜培养基替换原培养基。孵 育 36〜40 h 使产生重组病毒。

甘 油 休 克（合适的）

一些实验室在这一步进行甘油休克，以增加细胞核对导人 D N A 的吸收。在我们基
于 S N V 反转录病毒微粒生成的实验中，用甘油休克处理细胞与否没有很大的区别。

10•若选择甘油休克，则如下操作：

a•吸去培养基，用 5 ml PB S 或培养基洗两次。在清洗过程中摇晃平板并在显微镜
下观察，以确保大部分沉淀物被移去。若还有很多沉淀则重复清洗。

b. 加 入 2m l 已确定浓度的甘油到细胞中， 2〜4 min。
甘油的百分比在 10%〜2 0 % , 应根据经验决定。通常情况下，若对细胞的增殖能力无影响，则使用较高百分比的甘油。

c•弃去甘油， PB S 清洗，加 IO m l 新鲜培养基。

反转录病毒载体上清的收集

11.对于基于 SN V 载体生成的病毒，在 更 换 培 养 基 36〜4 0 h 后 ，收 集 转 染 的 293T 或D 17 细胞的上清液。将 其 至 于 15mi 离 心 管 中 ， 1500r/m in 离 心 5 min，弃去细胞碎片。

12•转移上清。立即用于滴度测定或_ 8 0 °C 冷冻直至需要用于转染。对 于 基 于 S N V 和R E V - A 的载体系统而言，用生物学滴度来衡量病毒的产量。上清要注意避免多次冻融，因为这样会导致反转录病毒滴度的严重减少。

反转录病毒微粒的浓缩

13.通 过 〇.45um 的滤膜过滤反转录病毒载体上清液。

不要用消化纤维滤膜，因为蛋白质会与滤膜结合，从而毁坏病毒膜表面。

14.H Bekman 超速离心机 SW4 转头 ， 4℃ ， 25 000r/m in 离 心 2 h 上清液。

15.缓慢地弃去上清，不搅动沉淀。用 50f J H B S S 重悬含反转录病毒微粒的沉淀。

16•确定浓缩的反转录病毒的滴度，详见下部分所描述，或一 80-C 冻存至下次应用。

由于冻融明显的减少滴度，特别是对 S N V , 所以最好现用现制。

确定反转录病毒的转导效率

此 流 程 需 要 或 其 他 报 道 基 因 整 合 到 转 移 载 体 中 。

17•确定反转录病毒滴度方法如下：

对于贴壁细胞
a•种植耙细胞 D17 (用 于 确 定 S N V 野生型包被假型的滴度）或 2 9 3 T , 完全培养基 ，密度小于 IXIO6个/IOOmm 平皿。生长 24 h。

b . 弃去培养基，加 I m l 病 毒 载 体 上 清 液 ，其 中 包 含 反 转 录 病 毒 微 粒 和 浓 度 为lO ug/m l 的聚凝胺。

或者，使用 Transfectam 试剂，浓度为 2ug/ml。 据观察， Transfectam 试剂比聚凝胺毒性小。

c. 3〜5 h 后（根据细胞类型），用 I O m l 新鲜培养基替换含有病毒的培养基。继续培养细胞 48 h 。
病毒感染细胞 5〜6 h 后为半剂量转染。过夜则为最大剂量转染。

d. 若有 诸 如 报 道 基 因 的 存 在 ，则 由 IacZ 试剂染色并计数蓝色细胞，从而以克隆形成单位（cfu) /m l 表示滴度。

若采用的是其他报道基因，则 可 采 取 免 疫 细 胞 化 学 或 实 时 聚 合 酶 链 反 应（PCR) 的方法，来精确检测基因表达和病毒滴度。

对 于 非 贴 壁 细 胞 的 转 导（悬 浮 细 胞）

a•转染前于 6 孔板中种植靶细胞 12〜18 h , 密度为 1.5X 106 个/m l 培养基。

b. 离心悬液中的细胞。在 聚 凝 胺（8ug/m l ) 或 Transfectam (2ug/m l ) 存在的情况下，在 病 毒 载 体 悬 液 中 以 1.5X 106 个/m l 的密度重悬细胞。如 前 所 述 ，T r a n s f e c t a m 由于毒性较小，是较好的选择。

c. 若采用聚凝胺作为转染试剂，则观察它对于细胞增殖和生长的作用是必需的，
因为悬浮细胞相对于贴壁细胞而言，其毒性效应更敏感一些。在振荡器上摇晃
平板。对 SNV，要产生最佳的转染效率，则聚凝胺的浓度在 8〜SOug/ml。

d. 4〜5 h 后离心弃去病毒微粒，完全培养基孵育 48 h ，如贴壁细胞所述。

e. 为了进一步增加效率，起始转染 12〜24 h 后可进行多次转染。

f. 固定并计数转染的细胞，确 定 cfu/m l 。

采 用 基 于 S N V 的反转录病毒微粒转导有丝分裂后的神经元细胞

此方法用于转移 Z a c Z 报道基因到有丝分裂后的分化的神经元细胞。

a. 根据先前由 M u k h t a r 等所描述的程序准备有丝分裂后的分化的神经元细胞。

b. 用 反 转 录 病 毒 微 粒 悬 液 和 T r a n s f e c t a m 试 剂（2ug/m l ) 混合覆盖细胞。放置 2 h 。

c. 重复反转录病毒微粒覆盖程序 3 次，间隔 24 h

d. 通过互补技术，确定这些有丝分裂后细胞中报道基因或治疗基因的表达。