随机引物法（在融化琼脂糖存在下利用随机寡核苷酸延伸进行DNA的放射标记）
原理此法系可用于从低熔点琼脂糖凝胶中回收 DNA 的放射性标记 ( Feinberg 和 Vogelstein 1983，1984)。材料与仪器大肠杆菌 DNA
原理
此法系可用于从低熔点琼脂糖凝胶中回收 DNA 的放射性标记 ( Feinberg 和 Vogelstein 1983，1984)。
材料与仪器
大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段 模板 DNA
醋酸氨 牛血清白蛋白 乙醇 溴化乙啶 NA 终止 贮存缓冲液 随机引物缓冲液
碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶 沸水浴 Sephadex G-50 离心柱
醋酸氨 牛血清白蛋白 乙醇 溴化乙啶 NA 终止 贮存缓冲液 随机引物缓冲液
碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶 沸水浴 Sephadex G-50 离心柱
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
醋酸氨（10 mol/L)
牛血清白蛋白（10 mg/ml)
乙醇
溴化乙啶（10 mg/ml）或 SYBR Gold 染液
NA 终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH8.0)，0.5% (m/V) SDS）
5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，20 mmol/L DTT，未标记的 dNTP 各 2 mmol/L，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至pH 6.6），1 mg/ml 长度为 6 个碱基的随机脱氧寡核苷酸引物）
2. 酶和缓冲液
大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段
3. 凝胶
碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶
4. 核酸和寡核苷酸
长度为 6 或 7 个碱基的随机脱氧核苷酸引物（125 ng/μl TE，pH 7.6 )
模板 DNA
5. 放射性复合物
[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 >3000 Ci/mmol）
6. 专用设备
沸水浴
Sephadex G-50 离心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡
二、方法
1. 电泳后用溴化乙锭（终浓度 0.5 μg/ml）或 SYBR Gold 染胶，切下所需条带，尽可能切去多余的凝胶。
2. 将切下的条带放入预先称过重量的微量离心管中，称出带的重量。每克琼脂糖凝胶加水 3 ml。
3. 将微量离心管放在沸水浴中煮 7 min 以使凝胶融化，同时也使 DNA 变性。
如立即进行标记，可将离心管置于 37℃，直至需要加入模板；否则可贮存于 -20℃。但每次从 -20℃ 取出后，含 DNA 的凝胶团要在 100℃ 加热 3~5 min，然后置于 37℃ 直至放射性标记反应开始。
4. 将一个新的微量离心管置于 37℃ 水浴或加热板上，按下列次序加入：
5X 寡核苷酸标记缓冲液 10 μl
10 mg/ml 牛血清白蛋白溶液 2 μl
DNA ( 体积不超过 32 μl） 20~50 ng
10 mCi/ml [α-32P] dNTP 5 μl
( 比活性 >3000 Ci/mmol）
Klenow 片段（5 单位） 1 μl
水 加至 50 μl
用微量加样器彻底混合各组分，于室温温育 2~3 h 或 37℃ 温育 60 min。
5. 在反应液中加入 10 μl NA 终止/贮存缓冲液，可根据需要进行以下步骤。
贮存放射性标记的探针于 -20℃ 以备杂交用。
或
通过离心柱层析分离放射性标记的探针与未结合的 dNTP 或以乙酸铵和乙醇选择性地沉淀放射性标记的 DNA。如果 >50% 的放射 性 dNTP 已在反应中掺入，可不进行该步骤。
1. 缓冲液和溶液
醋酸氨（10 mol/L)
牛血清白蛋白（10 mg/ml)
乙醇
溴化乙啶（10 mg/ml）或 SYBR Gold 染液
NA 终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH8.0)，0.5% (m/V) SDS）
5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，20 mmol/L DTT，未标记的 dNTP 各 2 mmol/L，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至pH 6.6），1 mg/ml 长度为 6 个碱基的随机脱氧寡核苷酸引物）
2. 酶和缓冲液
大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段
3. 凝胶
碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶
4. 核酸和寡核苷酸
长度为 6 或 7 个碱基的随机脱氧核苷酸引物（125 ng/μl TE，pH 7.6 )
模板 DNA
5. 放射性复合物
[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 >3000 Ci/mmol）
6. 专用设备
沸水浴
Sephadex G-50 离心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡
二、方法
1. 电泳后用溴化乙锭（终浓度 0.5 μg/ml）或 SYBR Gold 染胶，切下所需条带，尽可能切去多余的凝胶。
2. 将切下的条带放入预先称过重量的微量离心管中，称出带的重量。每克琼脂糖凝胶加水 3 ml。
3. 将微量离心管放在沸水浴中煮 7 min 以使凝胶融化，同时也使 DNA 变性。
如立即进行标记，可将离心管置于 37℃，直至需要加入模板；否则可贮存于 -20℃。但每次从 -20℃ 取出后，含 DNA 的凝胶团要在 100℃ 加热 3~5 min，然后置于 37℃ 直至放射性标记反应开始。
4. 将一个新的微量离心管置于 37℃ 水浴或加热板上，按下列次序加入：
5X 寡核苷酸标记缓冲液 10 μl
10 mg/ml 牛血清白蛋白溶液 2 μl
DNA ( 体积不超过 32 μl） 20~50 ng
10 mCi/ml [α-32P] dNTP 5 μl
( 比活性 >3000 Ci/mmol）
Klenow 片段（5 单位） 1 μl
水 加至 50 μl
用微量加样器彻底混合各组分，于室温温育 2~3 h 或 37℃ 温育 60 min。
5. 在反应液中加入 10 μl NA 终止/贮存缓冲液，可根据需要进行以下步骤。
贮存放射性标记的探针于 -20℃ 以备杂交用。
或
通过离心柱层析分离放射性标记的探针与未结合的 dNTP 或以乙酸铵和乙醇选择性地沉淀放射性标记的 DNA。如果 >50% 的放射 性 dNTP 已在反应中掺入，可不进行该步骤。
