λ噬菌体分离物的快速分析(从平板裂解物中纯化λDNA)实验

对有希望的基因组或 cDNA 克隆的分析，通常开始于用限制酶消化 λ 噬菌体 DNA 的小量制备物，并对消化产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。所获得的 DNA 可用作限制酶的底物、RNA 合成（由噬菌体 SP6、T3 和 T7 编码的依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶来完成）的模板以及 PCR 的模板。

λ 噬菌体重组子 大肠杆菌铺平板细菌
氯仿 乙醇 高盐缓冲液 Tris-Cl NaCl EDTA 异丙醇 低盐缓冲液 酚：氯仿 SM TE TM
LB 或 NZCYM 琼脂糖平板 LB 或 NZCYM 顶层琼脂糖 Sorvall SS-34 转子或相当型号 硼硅酸盐巴斯德吸管 Elutip-d 柱 水浴或加热设备 Whatman DE52

一、材料

1. 缓冲液和溶液

氯仿

乙醇

高盐缓冲液（20 mmol/L Tris-Cl (pH 7.4)，1.0 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)）

异丙醇

低盐缓冲液（20 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.4)，0.2 moI/L NaCl，1 mmoI/L EDTA (pH 8.0)）

酚：氯仿（1:1，V/V)

SM

TE ( pH 8.0)

TM

2. 培养基

LB 或 NZCYM 琼脂糖平板

LB 或 NZCYM 顶层琼脂糖

3. 离心机和转子

Sorvall SS-34 转子或相当型号

4. 专用设备

硼硅酸盐巴斯德吸管

Elutip-d 柱（Schleicher&Schuell）

预置于 47℃ 的水浴或加热设备

Whatman DE52

5. 载体和菌株

λ 噬菌体重组子，生长予菌苔上且完全独立的单个噬菌斑

大肠杆菌铺平板细菌

二、方法

裂解物的制备

1. 用硼硅酸盐吸管从平板上挑取 8~10 个完全独立的噬菌斑，而这些噬菌斑都来源于一个遗传上纯的、经噬菌斑纯化得到的噬菌体原种。将噬菌斑溶于 1 ml SM 和 50 μl 氯仿中，4℃ 放置 4~6 h，使噬菌体颗粒从顶层琼脂糖中溶解出来。

2. 将 50~100 μl 噬菌体悬浮液（约 105 pfu ) 与 150 μl 铺平板细菌在一无菌小培养管混匀，37℃ 温育 20 min，加入 7.0 ml 已熔（47℃）顶层琼脂糖（0.7%)，倒入新鲜灌制的 150 mm NZCYM 琼脂糖平板上进行涂布培养。

3. 平板 37℃ 倒置培养，直至噬菌斑几乎覆盖了整个平板表面（7~9 h)。

4. 直接加 7 ml TM 至顶层琼脂糖的表面，于 4℃ 温和地持续晃动温育 4 h，将噬菌体颗粒洗脱下来。

5. 将 λ 噬菌体洗脱液转移至一离心管中，经 4℃、4000 g ( 5800 r/min 于 Sorvall SS-34 转子中）离心 10 min 去掉细胞碎片。在这一步可留出小量清亮的裂解物组分作为噬菌体原种溶液，加入小量氯仿后于 4℃ 保存。

6. 取 10 ml 2:1 的 DE52 树脂悬液，转入离心管中。室温 500 g ( 2000 r/min 于 Sorvall SS-34 转子中）离心 5 min 沉淀树脂，去上清后将离心管置于冰浴中。

7. 用清亮的 TM 重新悬浮 DE52，通过在室温晃动离心管 3 min 使噬菌体颗粒吸附到树脂上。

8. 将 TM/DE52 悬液于 4000 g（5800 r/min 于Sorvall SS-34 转子中）离心 5 min，小心地将上清转移至另一新离心管中，重复离心步骤。每次离心后都去掉沉淀物。

9. 将第二次离心的上清转移至另一新离心管中，用酚：氯仿抽提上清一次，上清中含有 λ 噬菌体颗粒。

10. 将含 λ 噬菌体 DNA 的亲水相转移至一新的聚丙烯离心管中，加入等体积的异丙醇。将混合物于 -70℃ 保存 10 min。

11. 4℃、16500 g（12000 r/min 于 Sorvall SS-34 转子中）离心 20 min 收集沉淀的噬菌体 DNA。

12. 倒掉异丙醇，并让残余的也流干。将 DNA 沉淀物风干。

13. 用 2 ml 低盐缓冲液重溶 DNA 沉淀。

14. 用 Ehitip-d 柱进行层析以纯化噬菌体 DNA：

(1) 用注射器将 1~2 ml 高盐缓冲液推入 Elutip-d 柱。

(2) 将 5 ml 低盐缓冲液推入柱内。

(3) 将一 0.45 μm 的前滤膜（prefilter）粘贴在柱上，然后慢慢地将 DNA 样品（步骤 13 ) 推入柱内。

(4) 用 2~3 ml 低盐缓冲液清洗柱。

(5) 去掉前滤膜，用 0.4 ml 高盐缓冲液洗脱 DNA。在这一步，将洗脱液收集在一 1.5 ml 的微量离心管内。

15. 在 DNA 洗脱液中加入 1 ml 乙醇，将离心管上下颠倒数次，冰浴 20 min。在微量离心机中离心以去上清而收集 DNA 沉淀。用 0.5 ml 70% 乙醇冲洗 DNA 沉淀，去上清，然后使 DNA 风干。将 DNA 沉淀溶解于 50 μl TE ( pH 8.0)。