大量细菌克隆的杂交方法筛选实验
原理这一方法由 Hanahan 和 Meselson (1980, 1983)报道，主要用来处理由质粒 cDNA 文库转化的细菌。将转化菌的混合物或者一份扩增的
原理
这一方法由 Hanahan 和 Meselson (1980, 1983)报道，主要用来处理由质粒 cDNA 文库转化的细菌。将转化菌的混合物或者一份扩增的 cDNA 文库直接置于不含洗涤剂的硝酸纤维素膜或尼龙膜上，复制膜用膜-膜接触的方法制备。采用这一方法，每块 150 mm 板上的 2X104 克隆或每块 90 mm 板上的 1X104 克隆可以被复制，并作进一步杂交筛选。
材料与仪器
重组质粒转化的 E.coli
LB 或 SOB 琼脂板 平头镊子 18 号针头 硝酸纤维素膜 注射器 Whatman 3 MM 圆形滤纸
LB 或 SOB 琼脂板 平头镊子 18 号针头 硝酸纤维素膜 注射器 Whatman 3 MM 圆形滤纸
步骤
一、材料
1. 培养基
(1) 含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板。
本方案中使用 2~3 天旧板效果最好，因为旧板更容易吸收接种物中的水分。
(2) 含有适当抗菌素和 25% (V/V) 甘油的 LB 或 SOB 琼脂板。
(3) 含有氯霉素的 LB 或 SOB 琼脂板。
氯霉素贮存液浓度应为 170~200 μg/ml。
2. 专用设备
平头镊子（如 Millipore 镊子）
18 号针头
硝酸纤维素膜（Millipore HATF，或相当产品）或尼龙膜，无菌无去污剂污染
注射器（3 cc）
Whatman 3 MM 圆形滤纸。（提前准备一叠 Whatman 3 MM 滤纸（毎一硝酸纤维素或尼龙膜各准备一叠，还要加一些备用品），并裁减成比滤膜稍大一点。一些厂家已有预制好的圆形滤纸出售。用铅箔包好滤纸，高温高压消毒 [ 15 psi ( 1.05 kg/cm2) 10 min ]。
3. 载体和菌种
重组质粒转化的 E.coli，用作培养物。
或
扩增的 cDNA 文库，生长为培养物。
二、方法
1. 用软铅铅笔或圆珠笔在干滤膜上作好标记，用水浸湿后将湿滤膜夹在干的 3 MM 滤纸之间，用铝箔松散地包好，液相循环高温高压消毒 [ 15 psi (1.05 kg/cm2) 10 min]。
准备足够的滤膜用来从起始板制备 1 或 2 张备份。备份最好用消毒的无菌滤膜，但如果不再从主板制备备份，未消毒的滤膜也可以用。
2. 用平头镊子将一张消过毒的滤膜，标记面向下，置于含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板已制备 2~3 天，滤膜完全浸湿后，将其从板上揭下，翻过来标记面向上，再置于琼脂板表面。
3. 将小体积的菌液置于琼脂板表面的滤膜中心，用一个无菌玻璃棒使菌液分散，在滤膜四周留出 2~3 mm 宽的无菌区。
大滤膜（直径 137 mm）可提供 0.5 ml 细菌悬液，含 2X104 个活菌；小滤膜（直径 82 mm) 提供 0.2 ml 细菌悬液，含 ~104 个活菌。
4. 将琼脂板的盖半开（不要倒置）置于通风橱内数分钟使接种物中的水分蒸发，盖上盖子，颠倒琼脂板于 37℃ 培养直至出现直径 0.1~0.2 mm 的小菌落（约 8~10 h)。
5. 如需要，可在此时按步骤 6 制备备份滤膜，否则按以下步骤使菌落可冻存于 -20℃：
(1) 将滤膜菌落面向上转移至含有适当抗菌素和 25% 甘油的 LB 或 SOB 琼脂板表面。
(2) 于 37℃ 培养 2 h。
如进行 cDNA 文库筛选，最好将主板冰冻。冰冻可减少真菌污染使主板保存数月。含有抗菌素但不含甘油的 LB 或 SOB 板上的主滤膜可在 4℃ 保存 2 周。
(3) 用 Parafilm 膜封好琼脂板，颠倒置于封闭的塑料袋的于 -20℃ 保存。
于室温使主板（仍以颠倒位置 ) 解冻后即可制作备份。
6. 将主膜（硝酸纤维膜或尼龙膜）菌落面上置于无菌的 Whatman 3 MM 滤纸上。
7. 标记一张湿的硝酸纤维膜或尼龙膜，置于主膜上，防治在两膜之间形成气泡。
最好将第二张滤膜稍微卷曲，以使两张滤膜首先在中部接触。两膜一旦接触，就不要相互移动。尽量使两张滤膜不要完全重叠，以便于以后使两者分离。
8. 在滤膜上再盖一张圆形 3 MM 滤纸，并在滤纸上放一个培养皿，用手掌向下紧压培养皿以使细菌从主膜转到滤膜上。
9. 拿掉培养皿和顶层 3 MM 滤纸，用连接注射器的 18 号针头在双层滤膜作一些空，以作标记方位。
确保针头剌穿两层滤膜。
10. 使两膜分开，将备份膜置于新鲜的含有适当抗菌素的 LB ( 或 SOB ) 琼脂板。
此时，可按步制备第二张备份，用主膜上已有的孔标记第二张备份膜。
11. 将另一张备份膜和主膜置于新鲜的含有适当抗菌素的 LB ( 或 SOB) 琼脂板，于 37℃ 培养，直到长出菌落（4~6 h)。
12. 这一阶段，当细菌生长依然很快，滤膜可以转到含有氯霉素的（170~200 μg/ml) 的（或 SOB ) 琼脂板，于 37℃ 培养 12 h。
13. 将主膜转到新鮮的含有适当抗菌素和 25% 甘油的 LB ( 或SOB ) 琼脂板，而后按步骤 5 冻存。
14. 裂解附着于备份膜上菌落，将释放出的 DNA 固定于硝酸纤维膜或尼龙膜。进行杂交。
1. 培养基
(1) 含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板。
本方案中使用 2~3 天旧板效果最好，因为旧板更容易吸收接种物中的水分。
(2) 含有适当抗菌素和 25% (V/V) 甘油的 LB 或 SOB 琼脂板。
(3) 含有氯霉素的 LB 或 SOB 琼脂板。
氯霉素贮存液浓度应为 170~200 μg/ml。
2. 专用设备
平头镊子（如 Millipore 镊子）
18 号针头
硝酸纤维素膜（Millipore HATF，或相当产品）或尼龙膜，无菌无去污剂污染
注射器（3 cc）
Whatman 3 MM 圆形滤纸。（提前准备一叠 Whatman 3 MM 滤纸（毎一硝酸纤维素或尼龙膜各准备一叠，还要加一些备用品），并裁减成比滤膜稍大一点。一些厂家已有预制好的圆形滤纸出售。用铅箔包好滤纸，高温高压消毒 [ 15 psi ( 1.05 kg/cm2) 10 min ]。
3. 载体和菌种
重组质粒转化的 E.coli，用作培养物。
或
扩增的 cDNA 文库，生长为培养物。
二、方法
1. 用软铅铅笔或圆珠笔在干滤膜上作好标记，用水浸湿后将湿滤膜夹在干的 3 MM 滤纸之间，用铝箔松散地包好，液相循环高温高压消毒 [ 15 psi (1.05 kg/cm2) 10 min]。
准备足够的滤膜用来从起始板制备 1 或 2 张备份。备份最好用消毒的无菌滤膜，但如果不再从主板制备备份，未消毒的滤膜也可以用。
2. 用平头镊子将一张消过毒的滤膜，标记面向下，置于含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板已制备 2~3 天，滤膜完全浸湿后，将其从板上揭下，翻过来标记面向上，再置于琼脂板表面。
3. 将小体积的菌液置于琼脂板表面的滤膜中心，用一个无菌玻璃棒使菌液分散，在滤膜四周留出 2~3 mm 宽的无菌区。
大滤膜（直径 137 mm）可提供 0.5 ml 细菌悬液，含 2X104 个活菌；小滤膜（直径 82 mm) 提供 0.2 ml 细菌悬液，含 ~104 个活菌。
4. 将琼脂板的盖半开（不要倒置）置于通风橱内数分钟使接种物中的水分蒸发，盖上盖子，颠倒琼脂板于 37℃ 培养直至出现直径 0.1~0.2 mm 的小菌落（约 8~10 h)。
5. 如需要，可在此时按步骤 6 制备备份滤膜，否则按以下步骤使菌落可冻存于 -20℃：
(1) 将滤膜菌落面向上转移至含有适当抗菌素和 25% 甘油的 LB 或 SOB 琼脂板表面。
(2) 于 37℃ 培养 2 h。
如进行 cDNA 文库筛选，最好将主板冰冻。冰冻可减少真菌污染使主板保存数月。含有抗菌素但不含甘油的 LB 或 SOB 板上的主滤膜可在 4℃ 保存 2 周。
(3) 用 Parafilm 膜封好琼脂板，颠倒置于封闭的塑料袋的于 -20℃ 保存。
于室温使主板（仍以颠倒位置 ) 解冻后即可制作备份。
6. 将主膜（硝酸纤维膜或尼龙膜）菌落面上置于无菌的 Whatman 3 MM 滤纸上。
7. 标记一张湿的硝酸纤维膜或尼龙膜，置于主膜上，防治在两膜之间形成气泡。
最好将第二张滤膜稍微卷曲，以使两张滤膜首先在中部接触。两膜一旦接触，就不要相互移动。尽量使两张滤膜不要完全重叠，以便于以后使两者分离。
8. 在滤膜上再盖一张圆形 3 MM 滤纸，并在滤纸上放一个培养皿，用手掌向下紧压培养皿以使细菌从主膜转到滤膜上。
9. 拿掉培养皿和顶层 3 MM 滤纸，用连接注射器的 18 号针头在双层滤膜作一些空，以作标记方位。
确保针头剌穿两层滤膜。
10. 使两膜分开，将备份膜置于新鲜的含有适当抗菌素的 LB ( 或 SOB ) 琼脂板。
此时，可按步制备第二张备份，用主膜上已有的孔标记第二张备份膜。
11. 将另一张备份膜和主膜置于新鲜的含有适当抗菌素的 LB ( 或 SOB) 琼脂板，于 37℃ 培养，直到长出菌落（4~6 h)。
12. 这一阶段，当细菌生长依然很快，滤膜可以转到含有氯霉素的（170~200 μg/ml) 的（或 SOB ) 琼脂板，于 37℃ 培养 12 h。
13. 将主膜转到新鮮的含有适当抗菌素和 25% 甘油的 LB ( 或SOB ) 琼脂板，而后按步骤 5 冻存。
14. 裂解附着于备份膜上菌落，将释放出的 DNA 固定于硝酸纤维膜或尼龙膜。进行杂交。
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