原位末端转移酶标记技术检测凋亡

（一）原理

凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后，将DNA 切割成许多双链DNA 片段以及高分子量DNA 单链断裂点（缺口），暴露出大量3- 羟基末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT ）将标记的dUTP 进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标记法。

（二）荧光标记法

1 ．材料与试剂 采用德国Boehringer-Mannheim 公司In Situ Cell Death Detection 试剂盒，或美国Oncor 公司ApopTagTM 试剂盒，包括：

⑴生物素标记的-Dutp(Biotin-dUTP) 或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP) １nmol/µl

⑵ TdT 酶（25U/ μl ）

⑶ 反应缓冲液

⑷ 洗涤缓冲液

⑸ 异硫氰酸荧光素（FITC ）标记的亲合素或链霉亲合素（2.5µg/ml ）或抗地高辛抗体（1 �30 ）

⑹ PI 染液（含PI 5µg/ml 及无DNA 酶活性的RNA 酶0.1% ）

⑺ PBS 缓冲液

⑻ 塑料盖玻片

2. 样品

⑴ 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片

⑵ 贴壁生长的培养细胞

⑶ 冰冻切片

⑷ 常规石蜡切片

3. 操作方法

（1 ）固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4% 多聚甲醛固定30min(4 ℃) 后，用80% 酒精再固定2h （-20 ℃）。常规4% 中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。

（2 ）洗涤：玻片浸入PBS 缓冲液，摇床上洗涤5min, 三次。

（3 ）反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50 μl/ �2 滴加反应液（每50 μl 反应液含TdT 酶0.5 μl, 标记的-dUTP 1 μl ）, 使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上, 盖上塑料盖玻片, 置湿盒中,37 ℃孵育1h 。

（4 ）终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5min 。

（5 ）FITC 标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50 μl/ �2 滴加FITC 反应液（含FITC 2.5 μg/ml ），室温下避光孵育10min 。

（6 ）洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min 。

（7 ）PI 复染：将玻片置于盛有PI 染液的染色缸内，室温下避光染色30min 。

（8 ）封片：用盖玻片直接盖在含PI 染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察。

4. 结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光（波长488nm ），所有的细胞核均被PI 着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC ，显示出黄绿色荧光。

( 三) 酶标记法

1. 材料与试剂 采用美国Oncor 公司ApopTagTM -Peroxidase 试剂盒，包括：

⑴ 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体

⑵ 反应缓冲液

⑶ TdT 酶

⑷ 反应终止/ 洗涤液

⑸ 平衡缓冲液

⑹ 蛋白酶K 消化液：20 μg/ml 蛋白酶K 溶于PBS 。

⑺ 30% H2 O2

⑻ DAB 显色液：0.05% 的diaminobenzidine(DAB) 溶于PBS ，用前过滤并加入

0.02% H2 O2 。

⑼ 甲基绿染液：0.5% 甲基绿溶于0.1Mol/L 枸橼酸钠，pH 调整到4.0 。

⑽ 塑料盖玻片及玻璃盖玻片

2 ．样品 同荧光标记法。

3 ．操作方法

⑴ 固定：同荧光标记法。

⑵ 内源性过氧化物封闭 玻片置于盛有0.5% H2 O2 缓冲溶液的染色缸内，室温下作用20min 后，同荧光标记法洗涤。

⑶ 消化：玻片浸于盛有蛋白酶K 消化液的染色缸，室温下消化15min ，洗涤

同上。

⑷ 平衡处理：将细胞或组织周围液体用吸水纸吸干，滴加平衡缓冲液（按70µl ／cm2 ）覆盖细胞或组织表面，盖上塑料盖玻片，室温下作用5min ～10min 。

⑸ 反应：移去盖玻片，倾去平衡液，用吸水纸吸干周围液体，滴加反应液（按50µl/ �2 ，18 μl TdT 酶 36 μl 反应缓冲液），均匀覆盖在细胞或组织上，盖上塑料盖玻片，置于湿盒中，37 ℃温育1h 。

⑹ 终止反应：移去盖玻片，将玻片置于盛有终止/ 洗涤液的染色缸内，37 ℃下洗涤30min （置摇床上振摇）。然后将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min 。

⑺ 地高辛抗体反应：用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加70 μl 过氧化物酶标记的地高辛抗体，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下置于湿盒中，孵育30min 。

⑻ 洗涤：置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min 。

⑼ 用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加新鲜配制的DAB 显色液，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下作用3min ～6min 。

⑽ 洗涤：置于蒸馏水中洗涤3 次，每次3min ～6min 。

⑾ 套染：将玻片置于盛有甲基绿染液的染色缸中，室温染色10min 。

⑿ 洗涤：蒸馏水洗涤3 次（置于摇床上），每次2min 。

⒀ 脱水、封片：100% 正丁醇，3 次，每次2min 。二甲苯，3 次，每次2min 。

明胶甘油封片。

4 ．结果判定 光学显微镜下观察，所有的细胞核均着绿色，凋亡的细胞核染色质显示出特异性的棕黄色。

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