LAK(Lymphokine activated killer cell)细胞的培养

LAK(Lymphokine activated killer cell)细胞是用细胞因子（如IL-2、IL-12 等）活化的杀伤细胞。即采用自体或同种异体外周血淋巴细胞，在体外经细胞因子活化3~5 天，增强其广谱抗肿瘤作用的功能，并使数量大幅扩增，成为LAK 细胞，可用于肿瘤的治疗。 基本原理 应用人重组IL-2（hr12 等）于体外活化和扩增外周血淋巴细胞，使其成为经细胞因子活化的杀伤（LAK 细胞）。LAK 细胞呈现高度的MHC 限制的细胞毒作用。 试剂和材料 ●新鲜的外周（肝素）抗凝血（或胎肝、胎脾等）. ●淋巴细胞分离液、CMF-Hanks 液. ●培养基 1、RPMI1640 培养基：(RPMI+10mmol/LHEPES+2mmol/L 谷氨酰胺+庆大霉素250μg/ml ) 2、LAK 培养基：RPMI1640 培养液+10%人 AB 型血清+IL-2 1000μ/ml. 3、X-VIVO 15 培氧液. ●器皿与仪器。6 孔平底组织培养板75cm2 培养瓶、CO 2 孵箱。 实验操作 1、外周血单个细胞(PBMC)的制备：取病人自体或O 型供血者肝素抗凝血40ml（病人或供血者，最好经3 天IL-2 的体内诱导后采血），加等量CMF-Hanks 液稀释，用淋巴细胞分离液剃度离心（）2000r/min 离心20min），从分离液界面吸取淋巴细胞，即PBMC 。 2、用CMF-Hanks 液或PBSPBMC2 次，用LAK 培氧基（RPMI1640 培氧液+10%AB 型血清+1000μ/ml IL-2）或用含有1000μ/ml IL-2 的X-VIVO 15 培氧液竟PBMC 细胞浓度调至2x106/ml，竟细胞悬液移至6 孔平板培养板内，置5%CO2 孵箱，37℃培养4 ~ 5 天。 3、将增殖后的细胞悬液以280Kg、离心5min，收集上清液，冻存于-20℃待用（用于TIL 细胞培养 ）。 4、用RPMI1640 培氧液或X-VIVO15 培氧液洗离心的细胞2 次。 5、经 细胞计数 ，用输液用生理盐水重新悬浮细胞，调整细胞总数达5×10 8 ~ 1×10 9 回输给病 人。同时用形态学及功能分析等方法检测细胞活性，包括FACS 扫描分析、CTL 活性与NK活性，检测等。 [质控与提示] 1、LAK 细胞是从功能上而不是形态上定义的。这些细胞可表达多种表型，包括别激活的NK 细胞（CD56+、CD3-、CD25+）和细胞毒T（CTL）淋巴细胞（CD3+ 、CD8+），而且CTL 细胞也长表达CD56+标志，这些细胞对NK 抵抗性靶细胞（如RaJi）也具有细胞毒性。 2、制备LAK 细胞时，可用AIM-V 培氧液或加有10%胎牛 血清 的RPMI1640 代替X-VIVO15 培氧液。当用于治疗时禁用牛 血清 培养LAK 细胞。