荧光原位杂交实验基本方案

1a.  石蜡切片或细胞的杂交：按石蜡切片或细胞的原位杂交实验的基本方案步骤1~7，对载玻片进行脱蜡、水化、 封闭和脱水处理。将标本晾干（或在干燥器中干燥），随后贮于加有干燥剂的载玻片盒中，置-70℃过夜。

 

1b.  冰冻切片的杂交：按冰冻切片的原位杂交实验的备择方案步骤1~7，进行切片的预处理和乙酰化处理， 随后进行切片的脱水。

 

2.  对每一杂交实验，可用乙醇沉淀10~15 ng 探针，重溶于10 ml 去离子的甲酰胺中，加5 ug（0.5 ul）超声处理的鲑精DNA，在70~80℃温度下热变性探针10 min。

3.  加10 ul 主杂交混合液于变性探针中（探针终浓度为0.1~0.5 ug/ul 混匀），微量离心机以高速稍加离心，然后加于载玻片上。覆加22 mm2 盖玻片，轻压以赶去大的气泡。放入加湿盒中，在37℃温育2~4 h。

4.  杂交最后30 min 期间，以37℃水浴，在Coplin 广口瓶中，预热50 ml 50%甲酰胺/2xSSC洗液和50 ml 2xSSC。

 

5.  从加湿盒中取出载玻片，剥去橡皮泥（如有使用的话）并小心移去盖玻片。在37℃ 50%甲酰胺/2xSSC中，清冼杂交过的玻片15 min；接着以37℃ 2xSSC洗15 min；再于室温以1xSSC洗15 min。

 

6.  玻片在室温下，以4xSSC平衡5 min。取出载玻片吸去残余缓冲液，在此过程中任何时候都不要使玻片干涸。

7.  加50 ul 生物素检测液，地髙辛检测液或生物素/地高辛检测液于杂交过的载玻片上。用22 mm2 的Parafilm 膜覆盖，放在一用铝箔包裹的加湿盒中，于37℃温育45 min。

8.  室温下，按顺序在裹以铝箔的Coplin 广口瓶中，分别用4xSSC、0.1%Triton X-100/4xSSC和4xSSC浸洗切片。毎种溶液中浸洗10 min。

9.  加50 ul DAPI 或碘化丙锭染色液于切片上，以一块22 mm2 的Parafilm 膜覆盖。室温下染色5 min。在盛有1xSSC的Coplin 广口瓶中快速浸洗，以除去多余染液。吸去残液但不要使切片干涸。